Høy gjennomstrømningsanalyse av ikke-fotokjemisk slukking i avlinger ved bruk av pulsamplitudemodulert klorofyllfluorometri

Summary

Protokollen introduserer en høy gjennomstrømningsmetode for måling av avslapning av ikke-fotokjemisk slukking ved pulsamplitudemodulert klorofyllfluorometri. Metoden brukes på feltdyrket Glycine max og kan tilpasses andre arter for å screene for genetisk mangfold eller avlspopulasjoner.

Abstract

Fotosyntese er ikke optimalisert i moderne avlinger, og gir derfor en mulighet for forbedring. Påskynde avslapning av ikke-fotokjemisk slukking (NPQ) har vist seg å være en effektiv strategi for å øke fotosyntetisk ytelse. Imidlertid mangler potensialet for å avle for forbedret NPQ og en fullstendig forståelse av det genetiske grunnlaget for NPQ-avslapning på grunn av begrensninger av oversampling og datainnsamling fra feltdyrkede avlinger. Basert på tidligere rapporter presenterer vi en høy gjennomstrømningsanalyse for analyse av NPQ-avslapningshastigheter i Glycine max (soyabønne) ved bruk av pulsamplitudemodulert (PAM) klorofyllfluorometri. Bladskiver blir samplet fra feltdyrkede soyabønner før transport til et laboratorium hvor NPQ-avslapning måles i et lukket PAM-fluorometer. NPQ-relaksasjonsparametere beregnes ved å tilpasse en bi-eksponentiell funksjon til de målte NPQ-verdiene etter en overgang fra høyt til svakt lys. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å teste hundrevis av genotyper innen en dag. Prosedyren har potensial til å screene mutant- og mangfoldspaneler for variasjon i NPQ-avslapning, og kan derfor brukes på både grunnleggende og anvendte forskningsspørsmål.

Introduction

Fotosyntesen består av lysabsorpsjon, primær elektronoverføring, energistabilisering og syntese og transport av fotosyntetiske produkter¹. Å forstå hvert trinn er viktig for å veilede arbeidet med å øke avlingens fotosyntetiske effektivitet. Lys påvirker hastigheten på fotosyntesen, og krever balansering av energiforsyning, i form av fotoner, med etterspørsel etter å redusere ekvivalenter. Når tilbudet overstiger etterspørselen, for eksempel under høyt lys eller under redusert CO_2-fiksering forårsaket av stomatal lukking, øker oppbygging av reduserende effekt sannsynligheten for reaktiv oksygenartdannelse med potensial til å skade det fotosyntetiske apparatet og svekke elektrontransporten. Derfor, for å forhindre skade, har planter utviklet flere fotobeskyttende mekanismer, inkludert avgiftning av reaktive oksygenarter og ikke-fotokjemisk slukking av de eksiterte klorofylltilstandene (NPQ)².

Opprettholde høye nivåer av fotosyntese er utfordrende under et feltmiljø. Sesongmessige og daglige endringer, sammen med miljøsvingninger som vindinduserte bladbevegelser og forbigående skydekke, forårsaker endringer i mengden og intensiteten av lys mottatt av planter for fotosyntese³. NPQ sprer overflødig lysenergi og kan bidra til å forhindre fotoskader samtidig som det muliggjør vedvarende fotosyntese ved høyt lys⁴. Imidlertid fortsetter langvarig NPQ under overganger med høyt til lite lys å spre energi som kan brukes til karbonreduksjon⁵. Som et resultat kan påskynde avslapningen av NPQ øke effektiviteten av fotosyntese⁶, noe som gjør NPQ-avslapning til et attraktivt mål for avlingsforbedring.

Pulsamplitudemodulert klorofyllfluorescensanalyse (PAM) kan brukes til å beregne NPQ fra målbare parametere (supplerende tabell 1 og tilleggstabell 2)^7,8,9. Denne artikkelen fokuserer på å bestemme NPQ-avslapningshastigheter i feltdyrkede planter med det formål å screene naturlig variasjon i germplasma. Pam klorofyll fluorometri analyse kan imidlertid også brukes til en rekke formål, brukt på arter som spenner fra alger til høyere planter, og er gjennomgått andre steder ^7,8,9.

I et mørktilpasset blad eller celle er fotosystem II (PSII) reaksjonssentre åpne for å motta elektroner, og det er ingen NPQ. Å slå på et målelys med lav intensitet fremkaller klorofyllfluorescens mens du unngår elektrontransport gjennom PSII. Den registrerte minimumsfluorescensen i denne mørktilpassede tilstanden er beskrevet av parameteren F_o. Påføring av en høyintensitets lyspuls på et mørktilpasset blad kan raskt redusere den første stabile elektronakseptorpoolen av kinoner bundet til kinon A-stedet. Dette blokkerer midlertidig elektronoverføringskapasitet i PSII-reaksjonssentre, som da sies å være lukket og ikke i stand til å motta elektroner fra vannspalting. Ved å bruke kort pulsvarighet er det ikke nok tid til å stimulere NPQ. Den resulterende klorofyllfluorescensen er ekvivalent med den maksimale verdien som er oppnåelig i fravær av NPQ, eller maksimal fluorescens, F_m. Forskjellen mellom minimal og maksimal fluorescens refereres til som variabel fluorescens, F_v. Det maksimale fotokjemiske kvanteutbyttet til fotosystem II (F_v / F_m) beregnes ut fra disse to parametrene ved hjelp av følgende ligning:

F_v/F_m = (F_{m-F o})/F_m

Dette kan gi en viktig indikator på fotosystemfunksjon og stress. Å slå på et aktinisk (fotosyntetisk) lys stimulerer ikke-fotokjemisk slukking, og påfølgende påføring av en mettende blits muliggjør måling av lystilpasset maksimal fluorescens, F_m‘. Ved å sammenligne forskjellen mellom mørk og lystilpasset maksimal fluorescens, kan NPQ beregnes i henhold til Stern-Volmer-ligningen¹⁰:

NPQ = F_m/F_m‘ – 1

I høyere planter har NPQ blitt beskrevet som bestående av minst fem forskjellige komponenter, inkludert qE, qT, qZ, qI og qH. De nøyaktige mekanismene som er involvert i NPQ er ikke fullt ut forstått; qE anses imidlertid å være hovedkomponenten i NPQ i de fleste planter. Avgjørende faktorer for full involvering av qE har vist seg å inkludere oppbygging av en protongradient over thylakoidmembranen, aktiviteten til fotosystem II-underenhet S^11,12 og de-epoksyderte xantofyller, antheraxanthin, lutein og spesielt zeaxanthin¹³. qE slapper av raskest av alle NPQ-komponenter (< 2 min)¹⁴, og reversibel aktivering av qE er derfor spesielt viktig for tilpasning til skiftende lysintensiteter. En andre langsommere fase av NPQ-relaksasjon (~ 2-30 min) omfatter både qT, relatert til tilstandsoverganger, og qZ, som involverer interkonvertering av zeaxanthin til violaxanthin¹⁵. Langsom avslappende (> 30 min) av NPQ kan omfatte både fotoinhibitorisk slukking (qI) ¹⁶ og prosesser uavhengig av fotodamage^17,18, for eksempel qH, som er vedvarende slukking i de perifere antennene til PSII mediert av et plastid lipokalinprotein^19,20.

NPQ øker under eksponering for høyt lys. Senere overføring til svakt lys kan føre til nedregulering av NPQ. Forfallet av raske, mellomliggende og langsomme avslappende faser kan fanges opp i parametrene til en bi-eksponentiell funksjon 15,21,22,23

NPQ = Aq1^(-t/τ1) + Aq2^(-t/τ2) + Aq3

Det teoretiske grunnlaget for bi-eksponentiell funksjon er basert på antagelsen om førsteordens utnyttelse av hypotetiske quenchers, inkludert qE (Aq1), kombinert relaksasjon av qZ og qT (Aq2), med de tilsvarende tidskonstantene τq1 og τq2, og langsiktig NPQ, som inkluderer qI og fotodamage uavhengige prosesser (Aq3). Som sådan gir den bi-eksponentielle funksjonen en mer realistisk representasjon av de mange tilkoblede biologiske prosessene som er involvert i slukking av klorofyllfluorescens sammenlignet med en enklere Hill-ligning som mangler et teoretisk grunnlag²⁴.

NPQ kan måles ved hjelp av en rekke kommersielt tilgjengelige PAM-fluorometre^25,26, fra enkle håndholdte enheter²⁷ til mer avanserte lukkede systemer²⁸. En begrensning av flere av disse tilnærmingene er imidlertid en relativt lav gjennomstrømning, noe som gjør screening av store samlinger av planter utfordrende uten flere enheter og et team av forskere. For å løse dette problemet utviklet McAusland og medarbeidere en prosedyre basert på utskåret bladvev og brukte den til å identifisere forskjeller i klorofyllfluorescens mellom to hvetekulturer²⁹. Tiltrekningen av denne tilnærmingen er at bildebehandling av bladskiver, tatt fra flere planter med en enkelt enhet, kan lette screening av hundrevis av genotyper i løpet av en dag. Dette gjør det mulig å vurdere variasjon i NPQ-relaksasjon som en del av genomomfattende assosiasjonsstudier, eller for screening av avlspopulasjoner med potensial til å øke avlingsfotosyntetisk effektivitet og til slutt utbytte.

Basert på funnene fra McAusland et ^al.29, bruker vi PAM klorofyllfluorescensanalyse av bladskiver for høy gjennomstrømningsscreening av NPQ-avslapningshastigheter i Glycine max (G.max; soyabønne). Denne protokollen bruker CF Imager²⁵, som kan sammenlignes med andre kommersielt tilgjengelige lukkede PAM-systemer, for eksempel den populære FluorCam²⁶. Med et mørkt rom for tilpasning av prøver, kan brukerne bilde 96-brønns tallerkener, petriskåler og små planter. Den viktigste fordelen med denne tilnærmingen er økningen i gjennomstrømningen som tilbys ved bruk av bladskiver sammenlignet med sekvensiell analyse av individuelle planter. Her presenterer vi representative resultater, og en metode for prøvetaking, måling og analyse av NPQ i feltdyrkede planter.

Protocol

1. Frøplanting Velg et feltsted med fruktbar, godt drenert, men ikke sandholdig jord, og med en pH på nesten 6,5. Merk ut 1,2 m rad tomter med 0,75 m avstand ved å score bakken med en hakke. Plante 50 frø/m G.max cv. IA3023 på 3 cm dyp langs hver tomt i begynnelsen av vekstsesongen når jordtemperaturen er mellom 25 og 30 °C.MERK: For å screene genetisk mangfold forventes det at flere forskjellige genotyper dyrkes og sammenlignes. Plant 2-5 rader per genotype arran…

Representative Results

Figur 1A viser en typisk måling av NPQ i feltdyrket soyabønne. Planter ble dyrket i Urbana, IL (breddegrad 40.084604°, lengdegrad -88.227952°) sommeren 2021, med frø plantet 5. 2021. Bladskivene ble samplet etter 30 dager med planting av frø, og målinger ble gjort med protokollen som ble gitt (tabell 1). Fv/Fm – og NPQ-verdier ble beregnet for hver bladskive (supplerende tabell 4) og NPQ-relaksasjonsparametere ble beregnet ved å til…

Discussion

Nøye valg og håndtering av bladskiver er avgjørende for å oppnå pålitelige målinger av NPQ. For det første vil skade på vevet, for eksempel grov håndtering med pinsett, introdusere stress, noe som resulterer i lave verdier for maksimal kvanteeffektivitet av fotosyntese. Ikke-stressede planter har vanligvis F_v / F_m-verdier på rundt 0,83¹⁸, med signifikante nedganger som indikerer en reduksjon i fotosyntetisk ytelse⁹. Planter…

Materials

24 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012929	Country of Origin: United States of America
96 well tissue culture plate	Fisher Scientific	FB012931	Country of Origin: United States of America
Aluminum foil	Antylia Scientific	61018-56	Country of Origin: United States of America
Black marker pen	Sharpie	SAN30001	Country of Origin: United States of America
CF imager	Technologica Ltd.	N/A	chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom
Cork-borer, 7mm	Humboldt Mfg Co	H9665	Country of Origin: United States of America
FluorImager V2.305 Software	Technologica Ltd.	N/A	imaging software Country of Origin: United Kingdom
iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters	Amazon	B07P6XCTGV	Country of Origin: United States of America
Marker stakes	John Henry Company	KN0151	Country of Origin: United States of America
Paper scissors	VWR	82027-596	Country of Origin: United States of America
Parafilm	Bemis Company Inc.	S3-594-6	Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America
Solid rubber stoppers	Fisher Scientific	14-130M	Country of Origin: United States of America