Darbe Genliği Modülasyonlu Klorofil Florometrisi Kullanılarak Mahsullerde Fotokimyasal Olmayan Söndürmenin Yüksek Verimli Analizi
Summary
Protokol, fotokimyasal olmayan söndürmenin gevşemesini darbe genliği modülasyonlu klorofil florometri ile ölçmek için yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, tarlada yetiştirilen Glisin max’a uygulanır ve genetik çeşitliliği veya üreme popülasyonlarını taramak için diğer türlere uyarlanabilir.
Abstract
Fotosentez, modern mahsul çeşitlerinde optimize edilmemiştir ve bu nedenle iyileştirme için bir fırsat sağlar. Fotokimyasal olmayan söndürmenin (NPQ) gevşemesini hızlandırmanın, fotosentetik performansı artırmak için etkili bir strateji olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, gelişmiş NPQ için üreme potansiyeli ve NPQ gevşemesinin genetik temelinin tam olarak anlaşılması, tarlada yetiştirilen mahsul bitkilerinden aşırı örnekleme ve veri toplama sınırlamaları nedeniyle eksiktir. Önceki raporlara dayanarak, nabız genliği modülasyonlu (PAM) klorofil florometrisi kullanılarak Glisin max’taki (soya fasulyesi) NPQ gevşeme oranlarının analizi için yüksek verimli bir test sunuyoruz. Yaprak diskleri, NPQ gevşemesinin kapalı bir PAM-florometrede ölçüldüğü bir laboratuvara taşınmadan önce tarlada yetiştirilen soya fasulyesinden örneklenir. NPQ gevşeme parametreleri, yüksek ışıktan düşük ışığa geçişi takiben ölçülen NPQ değerlerine iki üstel bir fonksiyon takılarak hesaplanır. Bu yöntemi kullanarak, bir gün içinde yüzlerce genotipi test etmek mümkündür. Prosedür, NPQ gevşemesindeki varyasyon için mutant ve çeşitlilik panellerini tarama potansiyeline sahiptir ve bu nedenle hem temel hem de uygulamalı araştırma sorularına uygulanabilir.
Introduction
Fotosentez, ışık emilimi, birincil elektron transferi, enerji stabilizasyonu ve fotosentetik ürünlerin sentezi ve taşınmasından oluşur1. Her adımı anlamak, mahsulün fotosentetik verimliliğini artırma çabalarına rehberlik etmek için hayati öneme sahiptir. Işık, fotosentez hızını etkiler, fotonlar şeklinde dengeleyici enerji arzı gerektirir ve eşdeğerleri azaltma talebi vardır. Arz talebi aştığında, örneğin yüksek ışık altında veya stoma kapanmasının neden olduğu azaltılmış CO2 fiksasyonu sırasında, indirgeyici gücün birikmesi, fotosentetik cihaza zarar verme ve elektron taşınımını bozma potansiyeli olan reaktif oksijen türlerinin oluşma olasılığını artırır. Bu nedenle, hasarı önlemek için, bitkiler reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyonu ve uyarılmış klorofil durumlarının (NPQ) fotokimyasal olmayan söndürülmesi de dahil olmak üzere çeşitli foto-koruyucu mekanizmalar geliştirmiştir.
Yüksek fotosentez oranlarını korumak, bir saha ortamında zordur. Mevsimsel ve günlük değişiklikler, rüzgara bağlı yaprak hareketleri ve geçici bulut örtüsü gibi çevresel dalgalanmalarla birlikte, bitkiler tarafından fotosentez için alınan ışığın miktarında ve yoğunluğunda kaymalara neden olur3. NPQ, aşırı ışık enerjisini dağıtır ve yüksek ışıkta4’te sürekli fotosentez oranlarına izin verirken foto-hasarı önlemeye yardımcı olabilir. Bununla birlikte, yüksek ila düşük ışık geçişleri sırasında uzun süreli NPQ, karbon azaltma5 için kullanılabilecek enerjiyi dağıtmaya devam ediyor. Sonuç olarak, NPQ’nun gevşemesini hızlandırmak, fotosentez6’nın verimliliğini artırabilir ve NPQ gevşemesini mahsul iyileştirme için çekici bir hedef haline getirebilir.
Ölçülebilir parametrelerden NPQ’yu hesaplamak için darbe genliği modülasyonlu klorofil floresan (PAM) analizi kullanılabilir (Ek Tablo 1 ve Ek Tablo 2) 7,8,9. Bu makale, germplazmadaki doğal varyasyonun taranması amacıyla tarlada yetiştirilen bitkilerde NPQ gevşeme oranlarının belirlenmesine odaklanmaktadır. Bununla birlikte, PAM klorofil florometri analizi, alglerden daha yüksek bitkilere kadar değişen türlere uygulanan çok çeşitli amaçlar için de kullanılabilir ve başka bir yerdegözden geçirilmiştir 7,8,9.
Koyu renkli uyarlanmış bir yaprak veya hücrede, fotosistem II (PSII) reaksiyon merkezleri elektron almak için açıktır ve NPQ yoktur. Düşük yoğunluklu bir ölçüm ışığını açmak, PSII üzerinden elektron taşınmasını önlerken klorofil floresansını ortaya çıkarır. Bu karanlık uyarlanmış durumda kaydedilen minimum floresan, F o parametresi ile tanımlanır. Koyu renkli uyarlanmış bir yaprağa yüksek yoğunluklu bir ışık darbesi uygulamak, kinon A bölgesine bağlı kinonların ilk kararlı elektron alıcı havuzunu hızla azaltabilir. Bu, PSII reaksiyon merkezlerinde elektron transfer kapasitesini geçici olarak bloke eder, daha sonra kapalı olduğu ve su bölünmesinden elektron alamadığı söylenir. Kısa bir nabız süresi kullanarak, NPQ’yu uyarmak için yeterli zaman yoktur. Elde edilen klorofil floresansı, NPQ veya maksimum floresan Fm yokluğunda elde edilebilecek maksimum değere eşdeğerdir. Minimal ve maksimum floresan arasındaki fark, değişken floresan, F v olarak adlandırılır. Fotosistem II’nin (F v / Fm) maksimum fotokimyasal kuantum verimi, aşağıdaki denklem kullanılarak bu iki parametreden hesaplanır:
Fv/F m = (F m-Fo)/F m
Bu, fotosistem fonksiyonunun ve stresin önemli bir göstergesi olabilir. Aktinik (fotosentetik) bir ışığın açılması, fotokimyasal olmayan söndürmeyi uyarır ve daha sonra doygun bir flaşın uygulanması, ışığa uyarlanmış maksimum floresan, Fm’nin ölçülmesine izin verir. Karanlık ve ışığa adapte maksimum floresan arasındaki farkı karşılaştırarak, NPQ Stern-Volmer denklemi10’a göre hesaplanabilir:
NPQ = F m/Fm‘ – 1
Daha yüksek tesislerde, NPQ, qE, qT, qZ, qI ve qH dahil olmak üzere en az beş farklı bileşenden oluşan olarak tanımlanmıştır. NPQ’da yer alan kesin mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır; Bununla birlikte, qE, çoğu bitkide NPQ’nun ana bileşeni olarak kabul edilir. qE’nin tam katılımı için kritik faktörlerin, tilakoid membran boyunca bir proton gradyanının birikmesini, fotosistem II alt birimi S11,12’nin aktivitesini ve de-epoksitlenmiş ksantofillerin, antheraksantinin, lutein ve özellikle zeaksantin13’ün aktivitesini içerdiği bulunmuştur. qE, herhangi bir NPQ bileşeninin en hızlısını gevşetir (< 2 dakika)14 ve qE’nin geri dönüşümlü aktivasyonu, değişen ışık yoğunluklarına uyum sağlamak için özellikle önemlidir. NPQ gevşemesinin ikinci bir yavaş aşaması (~ 2-30 dakika), hem durum geçişleriyle ilgili qT’yi hem de zeaksantinin violaksantin15’e dönüşümünü içeren qZ’yi kapsar. NPQ’nun yavaş gevşemesi (> 30 dakika), hem fotoinhibitör söndürme (qI)16 hem de bir plastid lipokalin proteini 19,20 tarafından aracılık edilen PSII’nin periferik antenlerinde sürekli söndürme olan qH gibi fotohasar17,18’den bağımsız süreçleri içerebilir.
NPQ, yüksek ışığa maruz kalma sırasında artar. Daha sonra düşük ışığa geçiş, NPQ’nun aşağı regülasyonuna neden olabilir. Hızlı, orta ve yavaş gevşeme fazlarının bozunumu, iki üstel fonksiyonun parametrelerinde yakalanabilir 15,21,22,23
NPQ = Aq1(-t/τ1) + Aq2(-t/τ2) + Aq3
Bi-üstel fonksiyonun teorik temeli, qE (Aq1), qZ ve qT’nin (Aq2) birleşik gevşemesi, karşılık gelen zaman sabitleri τq1 ve τq2 ve qI ve fotohasardan bağımsız süreçleri (Aq3) içeren uzun vadeli NPQ dahil olmak üzere varsayımsal söndürücülerin birinci dereceden kullanımı varsayımına dayanmaktadır. Bu nedenle, bi-üstel fonksiyon, klorofil floresansının söndürülmesinde yer alan çoklu bağlantılı biyolojik süreçlerin, teorik bir temelden yoksun olan daha basit bir Hill denklemine kıyasla daha gerçekçi bir temsilini sağlar24.
NPQ, basit el tipi cihazlardan27’den daha gelişmiş kapalı sistemlere28’e kadar piyasada bulunan çeşitli PAM florometreleri25,26 kullanılarak ölçülebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşımların birçoğunun bir sınırlaması, birden fazla cihaz ve bir araştırmacı ekibi olmadan büyük bitki koleksiyonlarının taranmasını zorlaştıran nispeten düşük bir verimdir. Bu sorunu ele almak için, McAusland ve ark. eksize edilmiş yaprak dokusuna dayanan bir prosedür geliştirdi ve iki buğday çeşidi arasındaki klorofil floresansındaki farklılıkları tanımlamak için kullandı29. Bu yaklaşımın cazibesi, tek bir cihazla birden fazla bitkiden alınan görüntüleme yaprak disklerinin bir gün içinde yüzlerce genotipin taranmasını kolaylaştırabilmesidir. Bu, genom çapında ilişkilendirme çalışmalarının bir parçası olarak NPQ gevşemesindeki varyasyonun değerlendirilmesini veya mahsul fotosentetik verimliliğini ve nihayetinde verimi artırma potansiyeline sahip üreme popülasyonlarının taranmasını mümkün kılar.
McAusland ve ark.29’un bulgularına dayanarak, Glisin maksimumunda NPQ gevşeme oranlarının yüksek verimli bir şekilde taranması için yaprak disklerinin PAM klorofil floresan analizini kullanıyoruz (G.max; soya fasulyesi). Bu protokol, popüler FluorCam26 gibi ticari olarak temin edilebilen diğer kapalı PAM sistemleriyle karşılaştırılabilir olan CF Imager25’i kullanır. Örneklerin uyarlanması için karanlık bir oda ile kullanıcılar 96 kuyucuklu tabakları, Petri tabaklarını ve küçük bitkileri görüntüleyebilirler. Bu yaklaşımın en önemli avantajı, tek tek bitkilerin sıralı analizine kıyasla yaprak disklerin kullanılmasıyla sağlanan verimdeki artıştır. Burada temsili sonuçlar ve tarlada yetiştirilen bitkilerde NPQ’nun örneklenmesi, ölçülmesi ve analizi için bir yöntem sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaprak disklerin dikkatli seçimi ve kullanımı, NPQ’nun güvenilir ölçümlerini elde etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, cımbızla kaba kullanım gibi dokuya verilen hasar, strese neden olacak ve fotosentezin maksimum kuantum verimliliği için düşük değerlerle sonuçlanacaktır. Gerilmemiş bitkiler tipik olarak Fv / Fm değerlerine yaklaşık 0.8318’dir ve önemli düşüşler fotosentetik performansta bir azalmaya işaret eder<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Bill & Melinda Gates Vakfı, Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı ve İngiltere Dış, Milletler Topluluğu ve Kalkınma Ofisi tarafından OPP1172157 hibe numarası altında finanse edilen Artan Fotosentetik Verimliliği Gerçekleştirme (RIPE) araştırma projesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 24 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012929 | Country of Origin: United States of America |
| 96 well tissue culture plate | Fisher Scientific | FB012931 | Country of Origin: United States of America |
| Aluminum foil | Antylia Scientific | 61018-56 | Country of Origin: United States of America |
| Black marker pen | Sharpie | SAN30001 | Country of Origin: United States of America |
| CF imager | Technologica Ltd. | N/A | chlorophyll fluorescence imager Country of Origin: United Kingdom |
| Cork-borer, 7mm | Humboldt Mfg Co | H9665 | Country of Origin: United States of America |
| FluorImager V2.305 Software | Technologica Ltd. | N/A | imaging software Country of Origin: United Kingdom |
| iHank-Nose 100-Pack of Premium Nasal Aspirator Hygiene Filters | Amazon | B07P6XCTGV | Country of Origin: United States of America |
| Marker stakes | John Henry Company | KN0151 | Country of Origin: United States of America |
| Paper scissors | VWR | 82027-596 | Country of Origin: United States of America |
| Parafilm | Bemis Company Inc. | S3-594-6 | Semi -transparent flexible film Country of Origin: United States of America |
| Solid rubber stoppers | Fisher Scientific | 14-130M | Country of Origin: United States of America |
Referências
- Blankenship, R. E. . Molecular Mechanisms of Photosynthesis. , (2021).
- Murchie, E. H., Niyogi, K. K. Manipulation of photoprotection to improve plant photosynthesis. Plant Physiology. 155 (1), 86-92 (2011).
- Horton, P. Optimization of light harvesting and photoprotection: molecular mechanisms and physiological consequences. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 367 (1608), 3455-3465 (2012).
- Slattery, R. A., Ort, D. R. Photosynthesis: photosynthetic efficiency improvement. Encyclopedia of Biological Chemistry III (Third Edition). , 256-267 (2021).
- Zhu, X. -. G., Ort, D. R., Whitmarsh, J., Long, S. P. The slow reversibility of photosystem II thermal energy dissipation on transfer from high to low light may cause large losses in carbon gain by crop canopies: a theoretical analysis. Journal of Experimental Botany. 55 (400), 1167-1175 (2004).
- Kromdijk, J., et al. Improving photosynthesis and crop productivity by accelerating recovery from photoprotection. Science. 354 (6314), 857-861 (2016).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. Journal of Experimental Botany. 51 (345), 659-668 (2000).
- Murchie, E. H., Lawson, T. Chlorophyll fluorescence analysis: a guide to good practice and understanding some new applications. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3983-3998 (2013).
- Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59 (1), 89-113 (2008).
- Bilger, W., Björkman, O. Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canariensis. Photosynthesis Research. 25 (3), 173-185 (1990).
- Li, X. -. P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
- Niyogi, K. K. PHOTOPROTECTION REVISITED: genetic and molecular approaches. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 50 (1), 333-359 (1999).
- Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll fluorescence quenching: mechanism and effectiveness in protecting plants from photodamage. Plant physiology. 170 (4), 1903-1916 (2016).
- Krause, G. H., Vernotte, C., Briantais, J. -. M. Photoinduced quenching of chlorophyll fluorescence in intact chloroplasts and algae. Resolution into two components. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 679 (1), 116-124 (1982).
- Nilkens, M., et al. Identification of a slowly inducible zeaxanthin-dependent component of non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence generated under steady-state conditions in Arabidopsis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1797 (4), 466-475 (2010).
- Krause, G. H. Photoinhibition of photosynthesis. An evaluation of damaging and protective mechanisms. Physiologia Plantarum. 74 (3), 566-574 (1988).
- Brooks, M. D., Sylak-Glassman, E. J., Fleming, G. R., Niyogi, K. K. A thioredoxin-like/β-propeller protein maintains the efficiency of light harvesting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (29), 2733-2740 (2013).
- Demmig, B., Björkman, O. Comparison of the effect of excessive light on chlorophyll fluorescence (77K) and photon yield of O2 evolution in leaves of higher plants. Planta. 171 (2), 171-184 (1987).
- Malnoë, A., et al. The plastid lipocalin LCNP is required for sustained photoprotective energy dissipation in Arabidopsis. The Plant Cell. 30 (1), 196-208 (2018).
- Amstutz, C. L., et al. An atypical short-chain dehydrogenase-reductase functions in the relaxation of photoprotective qH in Arabidopsis. Nature Plants. 6 (2), 154-166 (2020).
- Dall’Osto, L., Cazzaniga, S., Wada, M., Bassi, R. On the origin of a slowly reversible fluorescence decay component in the Arabidopsis npq4 mutant. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1640), 20130221 (2014).
- Chekanov, K., et al. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable conditions and under stress. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1863 (10), 1429-1442 (2019).
- Allorent, G., et al. A dual strategy to cope with high light in Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Cell. 25 (2), 545-557 (2013).
- Holzwarth, A. R., Lenk, D., Jahns, P. On the analysis of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching curves: I. Theoretical considerations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1827 (6), 786-792 (2013).
- Barbagallo, R. P., Oxborough, K., Pallett, K. E., Baker, N. R. Rapid, noninvasive screening for perturbations of metabolism and plant growth using chlorophyll fluorescence imaging. Plant physiology. 132 (2), 485-493 (2003).
- Nedbal, L., Soukupová, J., Kaftan, D., Whitmarsh, J., Trtílek, M. Kinetic imaging of chlorophyll fluorescence using modulated light. Photosynthesis Research. 66 (1), 3-12 (2000).
- Kuhlgert, S., et al. MultispeQ Beta: a tool for large-scale plant phenotyping connected to the open PhotosynQ network. Royal Society Open Science. 3 (10), 160592 (2016).
- Cruz, J. A., et al. Dynamic environmental photosynthetic imaging reveals emergent phenotypes. Cell Systems. 2 (6), 365-377 (2016).
- McAusland, L., Atkinson, J. A., Lawson, T., Murchie, E. H. High throughput procedure utilising chlorophyll fluorescence imaging to phenotype dynamic photosynthesis and photoprotection in leaves under controlled gaseous conditions. Plant Methods. 15 (1), 109 (2019).
- Woo, N. S., Badger, M. R., Pogson, B. J. A rapid, non-invasive procedure for quantitative assessment of drought survival using chlorophyll fluorescence. Plant Methods. 4 (1), 27 (2008).
- Bielczynski, L. W., Łącki, M. K., Hoefnagels, I., Gambin, A., Croce, R. Leaf and plant age affects photosynthetic performance and photoprotective capacity. Plant Physiology. 175 (4), 1634-1648 (2017).
- Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Physiology and metabolism. 16 (3), 307-314 (2013).
- Delosme, R., Olive, J., Wollman, F. -. A. Changes in light energy distribution upon state transitions: an in vivo photoacoustic study of the wild type and photosynthesis mutants from Chlamydomonas reinhardtii. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1273 (2), 150-158 (1996).
- Quick, W. P., Stitt, M. An examination of factors contributing to non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in barley leaves. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 977 (3), 287-296 (1989).
- Horton, P., Hague, A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 932, 107-115 (1988).
