نقدم بروتوكولا لتوصيف الصبغات الضوئية ثنائية الاستقرار من الناحية الكهروفسيولوجية: (i) استغلال إزاحات الشحنة داخل جزيئات التصبغ الضوئي بعد امتصاص الفوتون وكميتها الضخمة في المستقبلات الضوئية ، و (ii) استغلال اختلافات أطياف الامتصاص في حالات الصبغ الضوئي للرودوبسين والميتارودوبسين. هذه البروتوكولات مفيدة للكشف عن الطفرات التي تؤثر على أنظمة التصبغ الضوئي ثنائية الاستقرار.
يتكون الرودوبسين (R) من بروتين ذبابة الفاكهة G-protein (R) من بروتين (opsin) وكروموفور. تبدأ عملية تنشيط رودوبسين عن طريق أيزومرات الكروموفور المحرض على امتصاص الفوتون ، مما يعزز التغيرات التوافقية للأوبسين وينتج عنه حالة صبغية ضوئية ثانية مظلمة مستقرة (metarhodopsin، M). يتطلب التحقيق في هذا الصباغ الضوئي ثنائي الاستقرار باستخدام الطفرات العشوائية طرقا بسيطة وقوية لفحص الذباب المتحور. لذلك ، تم تصميم عدة طرق لقياس التخفيضات في مستويات الصباغ الضوئي الوظيفية. إحدى هذه الطرق تستغل إزاحات الشحنة داخل الصبغة الضوئية بعد امتصاص الفوتون والكميات الهائلة من جزيئات الصباغ الضوئي المعبر عنها في المستقبلات الضوئية. يتم قياس هذه الإشارة الكهربائية ، التي تسمى جهد المستقبل المبكر (أو تيار المستقبل المبكر) ، من خلال مجموعة متنوعة من الطرق الكهروفسيولوجية (على سبيل المثال ، مخطط كهربية الشبكية وتسجيلات الخلية بأكملها) وهي تتناسب خطيا مع مستويات التصبغ الضوئي الوظيفية. مزايا هذه الطريقة هي نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية ، والقياس الخطي المباشر لمستويات الصباغ الضوئي ، واستقلال آليات النقل الضوئي في اتجاه مجرى النهر إلى تنشيط رودوبسين أو ميتارودوبسين. وهناك طريقة كهروفسيولوجية إضافية تسمى الجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) تستغل الاستقرار الثنائي لصبغة ذبابة الفاكهة الضوئية والاختلافات الطيفية في الامتصاص الطيفي لحالات الصباغ R و M الذبابة. يتم تحفيز PDA بواسطة الضوء الأزرق المكثف ، وتحويل كميات مشبعة من رودوبسين إلى metarhodopsin ، مما يؤدي إلى فشل إنهاء استجابة الضوء لفترة طويلة في الظلام ، ولكن يمكن إنهاؤه عن طريق تحويل metarhodopsin إلى rhodopsin باستخدام الضوء البرتقالي المكثف. نظرا لأن PDA عبارة عن إشارة قوية تتطلب تحويلا ضوئيا هائلا ، حتى العيوب الصغيرة في التكوين الحيوي للصبغة الضوئية تؤدي إلى PDA غير طبيعي يمكن اكتشافه بسهولة. في الواقع ، أدت طفرات PDA المعيبة إلى تحديد بروتينات إشارات جديدة مهمة للنقل الضوئي.
يتكون رودوبسين المنشط بالضوء (R) ، وهو مستقبل مقترن ببروتين G (GPCR) ، من 7 بروتين عبر الغشاء (opsin) وكروموفور. في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر (ذبابة الفاكهة) ، يحفز امتصاص الفوتون أيزومرات كروموفور الشبكية 11-cis-3-OH-إلى الشبكية 1-trans-3-OH-1 ، مما يعزز التغيير التوافقي للرودوبسين إلى metarhodopsin (M ، الشكل 1A). على عكس رودوبسين الفقاريات ، فإن الجزء السائد من كروموفور اللافقاريات لا ينفصل عن الأوبسين ، مما يؤدي إلى حالة الصباغ المستقرة المظلمة النشطة من الناحية الفسيولوجية M. في المقابل ، يؤدي امتصاص الفوتون الإضافي بواسطة كروموفور الشبكية عبر 3-OH-retinal بالكامل إلى تحفيز أيزومرات الكروموفور 2,3 ، مما يولد حالة الصباغ R مع كروموفور 11-cis-3-OH-retinal . الحالة R هي صبغة ضوئية مظلمة ومستقرة وغير نشطة من الناحية الفسيولوجية. بالإضافة إلى مسار تجديد الفوتون السريع للغاية للكروموفور4 ، مثل الكثير من الصبغات الضوئية الفقارية ، يوجد طريق بطيء إنزيمي بديل لتجديد الكروموفور في اللافقاريات ، حيث يتم تنفيذ بعض المراحل في خلايا الشبكية المحيطة بخلايا المستقبلات الضوئية 5,6.
تستلزم ذبابة الفاكهة مزايا كبيرة ككائن حي نموذجي لدراسة المستقبلات الضوئية لللافقاريات. على وجه الخصوص ، جعلت إمكانية الوصول إلى التحضير والقدرة على تطبيق علم الوراثة الجزيئية ذبابة الفاكهة نظاما نموذجيا قويا7. وبالتالي ، تم إنشاء العديد من الطرق التجريبية في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لدراسة النقل الضوئي بشكل عام ومستويات الصباغ الضوئي ، على وجه الخصوص. تستغل أبسط طريقة في الجسم الحي استجابة الجهد الكبيرة نسبيا المسجلة خارج الخلية لضوء عين ذبابة الفاكهة. وفقا لذلك ، يثير التحفيز الضوئي استجابة الجهد الكهربائي في العين بأكملها والتي يمكن قياسها باستخدام تسجيل مخطط كهربية الشبكية خارج الخلية (ERG) ، وهو أكبر ب 3 أوامر من استجابة ERG لضوء عيون الفقاريات 8,9. استجابة ذبابة الفاكهة ERG قوية ويمكن الحصول عليها بسهولة ، مما يجعلها طريقة ملائمة لتحديد التشوهات في الاستجابة الخفيفة بسبب الطفرات. تنشأ استجابة ERG للضوء بشكل رئيسي من المستقبلات الضوئية والخلايا الصبغية (الدبقية) والخلايا العصبية الثانوية للصفيحة (انظر الشكل 1B). المكونات الرئيسية ل ERG هي (i) استجابة الجهد خارج الخلية للمستقبلات الضوئية ، (ii) العابرات “on” و “off” في بداية ونهاية التحفيز الضوئي الذي ينشأ من الخلايا العصبية الصفيحية (الشكل 2A ، inset ، ON ، OFF) ، (iii) الاستجابة البطيئة للخلايا الدبقية (الشكل 2A ، inset ، الأسهم) ، و (iv) الاستجابة القصيرة والعابرة ، الناتجة عن إزاحة الشحنة أثناء تنشيط الصباغ الضوئي الذي يسبق ON العابر10 (الشكل 2C [inset] ، D ، E). تتكون هذه الاستجابة الموجزة من مرحلتين (M1 و M2 ، الشكل 2C [inset]) ولا يمكن تحفيزها إلا عن طريق تحفيز الضوء القوي للغاية ، والذي ينشط في وقت واحد ملايين جزيئات الصباغ الضوئي. لا يلاحظ تحت التحفيز الأزرق (الشكل 2D ، التتبع الأزرق) ولا في الطفرات ذات مستويات التصبغ الضوئي المنخفضة للغاية (الشكل 2E ، التتبع الأحمر) ، ولكن يتم تعزيز سعته بشكل معتدل في المتحور الذي يلغي نشاط PLC (الشكل 2E ، التتبع البرتقالي). مرحلة M1 هي تخطيط موارد المؤسسات النموذجي للذبابة الناشئة عن تنشيط M في المستقبلات الضوئية. المرحلة M1 ، التي لها قطبية إيجابية (داخل الخلايا) ، تطلق ناقلا عصبيا بالطريقة العادية في مشبك مقلوب للعلامة وينشط الخلايا العصبية الصفيحية ، التي تستجيب لإزالة الاستقطاب من المستقبلات الضوئية عن طريق توليد مرحلة M2 المضخمة بشكل متشابك. وبالتالي ، تعكس كل من مرحلتي M1 و M2 تنشيط M10,11.
يولد إزالة الاستقطاب للمستقبلات الضوئية المرحلة العابرة “على” إيجابية القرنية ، الناشئة عن المشبك المقلوب للعلامة بين محور المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية أحادية القطب للصفيحة 10,11 (الشكل 1B). ينشأ الارتفاع البطيء والاضمحلال ل ERG من إزالة الاستقطاب من الخلايا الصبغية (الشكل 2A ، الجزء الداخلي ، الأسهم) ويرجع ذلك أساسا إلى تدفق K + من خلايا المستقبلات الضوئية12 عبر القنوات المحتملة للمستقبلات العابرة (TRP) والقنوات الشبيهة ب TRP (TRPL) 13،14،15. هذه المكونات الحركية البطيئة تخفي إلى حد كبير وتشوه الشكل الموجي لاستجابة المستقبلات الضوئية عند مقارنتها بالتسجيلات داخل الخلايا أو الخلايا الكاملة لاستجابة المستقبلات الضوئية للضوء 9,10. بالإضافة إلى ذلك ، في الإضاءات القوية جدا ، يمكن ملاحظة استجابة عابرة إضافية ، تسبق وتندمج جزئيا مع العابر “على” (الشكل 2C [inset] ، D ، E). تنشأ هذه الإشارة مباشرة من التنشيط الهائل للصبغة الضوئية10.
تم تطوير العديد من بروتوكولات نظام الضوء باستخدام الكثافة المحايدة (ND) ومرشحات الألوان ، بالإضافة إلى ومضات الإضاءة القوية ، للتحقيق في العين بشكل عام وشلال النقل الضوئي بشكل خاص. كما تم استخدام هذه البروتوكولات للتحقيق في خصائص الصباغ الضوئي.
يقيس بروتوكول الاستجابة للشدة سعة الذروة لاستجابة جهد ERG للعين بأكملها لزيادة شدة الضوء (الشكل 2A ، B). يساعد هذا البروتوكول في الكشف عن التغيرات في حساسية خلايا المستقبلات الضوئية للضوء9.
يستغل بروتوكول الجهد اللاحق لإزالة الاستقطاب لفترات طويلة (PDA) الاختلافات في أطياف امتصاص رودوبسين وميتارودوبسين التي تسمح ، في ذبابة الفاكهة ، بتحويل صبغي ضوئي هائل ل R إلى حالتها المتوسطة M2 النشطة فسيولوجيا والمستقرة في الظلام. في استجابة الجهد ERG ، يتم إعطاء نبضة قصيرة نسبيا من الضوء المشبع ، ويتم تسجيل استجابة الجهد الناتجة. في ظل هذه الحالة ، يتم الوصول إلى السقف (إمكانات الانعكاس) بواسطة إشارة إزالة الاستقطاب لأن تنشيط جزء من النسبة المئوية من الكمية الضخمة من جزيئات رودوبسين (~ 1 × 108) يكفي للوصول إلى السقف. يضمن وجود مكونات النقل الضوئي بوفرة كبيرة الوصول إلى هذا السقف حتى في الطفرات مع انخفاض كبير في التركيز أو خلل دقيق في مكونات النقل الضوئي. هذا الوضع يحول دون عزل هذه المتحورات. قدم باك وآخرون فحص PDA7 بحثا عن اختبار موثوق به وكاشف لعزل الطفرات البصرية. في ذبابة الفاكهة ، يتم تحقيق استجابة PDA عن طريق إزالة صبغة الفحص الحمراء وراثيا ، والتي تسمح بتحويل التصبغ الضوئي ، وتطبيق الضوء الأزرق ، الذي يتم امتصاصه بشكل تفضيلي بواسطة رودوبسين (الشكل 3A) ، وبالتالي ، يؤدي إلى تحويل صافي كبير من R إلى حالة الصباغ الضوئي M. يتم تعطيل إنهاء النقل الضوئي على مستوى الصباغ الضوئي عن طريق تحويل صافي كبير من R إلى M ، مما يؤدي بدوره إلى إثارة مستمرة بعد فترة طويلة من إطفاء الضوء (الشكل 2C ، الشكل 4A [أعلى]). خلال فترة PDA ، تكون المستقبلات الضوئية أقل حساسية لأضواء الاختبار اللاحقة ويتم إلغاء حساسيتها جزئيا (تعطيلها). يكتشف PDA حتى العيوب الطفيفة في التكوين الحيوي للرودوبسين ويختبر القدرة القصوى لخلية المستقبلات الضوئية للحفاظ على الإثارة لفترة طويلة. نظرا لأنه يعتمد بشكل صارم على وجود تركيزات عالية من رودوبسين ، فإنه يسجل بسهولة لتجديد نقص مكونات النقل الضوئي. ومن اللافت للنظر أن شاشة المساعد الشخصي الرقمي قد أسفرت عن العديد من الطفرات البصرية الجديدة والمهمة جدا (تمت مراجعتها في Pak et al.7). وبالتالي ، فإن طفرات PDA المعزولة بواسطة Pak et al.7 لا تزال مفيدة للغاية لتحليل النظام البصري ذبابة الفاكهة.
يتم تحفيز PDA في ذبابة الفاكهة عن طريق تشبع الضوء الأزرق ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب المستمر لفترة طويلة بعد إزاحة الضوء (الشكل 4A [أعلى]). بعد تشبع الضوء الأزرق المسبب للمساعد الشخصي الرقمي ، تظل المستقبلات الضوئية الطرفية (R1-6) نشطة باستمرار في الظلام بأقصى طاقتها ، وتصل إلى التشبع. لا تنتج الأضواء الزرقاء المشبعة الإضافية أثناء PDA أي استجابة إضافية في خلايا R1-6 لعدة ثوان ولكنها تحفز استجابة في خلايا R7-8 التي يتم تركيبها على PDA. يتم تفسير الاستجابات المتراكبة من خلال أطياف الامتصاص المختلفة للأصباغ الضوئية المعبر عنها في هذه الخلايا (R7-8)16. يمكن قمع المساعد الرقمي الشخصي عن طريق التحويل الضوئي ل M مرة أخرى إلى R مع ضوء برتقالي مشبع (الشكل 4A [أعلى]). إن قدرة المساعد الشخصي الرقمي على جلب خلايا المستقبلات الضوئية إلى أقصى قدرة نشطة لها ، وهو وضع لا يمكن تحقيقه بواسطة الضوء الأبيض المكثف ، يفسر لماذا كان أداة رئيسية لفحص الطفرات البصرية لذبابة الفاكهة. هذا لأنه يسمح بالكشف عن حتى العيوب الطفيفة في البروتينات المشاركة في التكوين الحيوي لمستويات التصبغ الضوئي الطبيعية17,18. تم عزل مجموعتين من الطفرات المعيبة PDA: لا التعطيل ولا الطفرات اللاحقة (nina) والتعطيل ولكن ليس الطفرات اللاحقة (de). النمط الظاهري للأول هو نقص في المساعد الشخصي الرقمي وما يرتبط به من تعطيل ناشئ عن انخفاض كبير في مستويات الصباغ الضوئي (الشكل 4A [في الوسط]). يظهر النمط الظاهري لهذا الأخير تعطيلا ولكن لا يوجد إزالة استقطاب مظلمة بعد الضوء الأزرق بسبب آلية لا تزال غير معروفة في المتحور مع مستويات رودوبسين طبيعية ولكنها تفتقر إلى البروتينات التي تتفاعل مع قنوات TRP (الشكل 4A [أسفل]).
ينشأ PDA من الاختلاف في كمية الصباغ الضوئي بالنسبة إلى الاعتقالين (ARR2) ، والذي يربط وينهي نشاط M 19,20,21 (الشكل 1A). في المستقبلات الضوئية ذبابة الفاكهة ، تكون كمية الصباغ الضوئي أكبر بحوالي خمسة أضعاف من كمية ARR219. وبالتالي ، فإن مستويات ARR2 غير كافية لتعطيل جميع جزيئات M الناتجة عن تحويل ضوئي صافي كبير من R إلى M ، مما يترك فائضا من M نشطا باستمرار في الظلام17،19،20،22،23. تفسر هذه الآلية القضاء على استجابة PDA عن طريق الطفرات أو عن طريق الحرمان من الكاروتينويد24,25 ، مما يسبب انخفاضا في مستوى التصبغ الضوئي ، ولكنه لا يؤثر على مستويات الاعتقال. علاوة على ذلك ، يفسر هذا التفسير أيضا الأنماط الظاهرية للأليل الطافر ARR2 (arr23) 21 ، حيث يمكن تحقيق PDA عند كثافة الضوء الأزرق الباهت ~ 10 أضعاف 19,20,21 (الشكل 4B ، C). المساعد الشخصي الرقمي ليس ميزة فريدة من نوعها للمستقبلات الضوئية الذبابة ، ويظهر في كل الأنواع المختبرة التي لديها M مستقرة داكنة مع طيف امتصاص مختلف عن حالة R ، مما يسمح بالتحويل الضوئي الكافي للصبغة الضوئية من R إلى الحالة M. من الأنواع التي تم التحقيق فيها بدقة والتي تم اكتشاف ظواهر PDA فيها مستقبلات الضوء barnacle (Balanus) ، حيث يكون طيف الامتصاص لحالة R في طول موجي أطول من الحالة M2 (الشكل 3B). وفقا لذلك ، على عكس الوضع في الذبابة ، في البارناكل ، يحفز الضوء البرتقالي الأحمر المساعد الشخصي الرقمي ، بينما يقمع الضوء الأزرق PDA2.
يستغل بروتوكول إمكانات المستقبلات المبكرة (ERP) إزاحة الشحنة التي تحدث أثناء تنشيط R أو M. الصباغ البصري هو جزء لا يتجزأ من الغشاء السطحي لحجرة الإشارات لكل من الأغشية الفقارية واللافقارية3. وفقا لذلك ، فإن عملية التنشيط التي تتغير فيها جزيئات الصباغ الضوئي من حالة وسيطة إلى أخرى مصحوبة بإزاحة شحنة 4,26. نظرا لأن جزيئات الصباغ الضوئي محاذاة كهربائيا بالتوازي مع سعة الغشاء4 ، فإن التغيير التوافقي المتزامن السريع يولد تغييرا سريعا في الاستقطاب للغشاء السطحي ، والذي يحدث ، في الذباب ، في حجرة الإشارات المكونة من كومة من ~ 30،000-50،000 من الزغابات الدقيقة تسمى rhabdomere. ثم يصب هذا الاستقطاب بشكل سلبي من خلال سعة الغشاء لجسم الخلية حتى يتم استقطاب غشاء الخلية بالتساوي. ERP هو التسجيل خارج الخلية لإزاحة الشحنة. يظهر ERP المسجل داخل الخلايا ERP ERP خارج الخلية المتكامل بواسطة ثابت الوقت لغشاء الخلية 4,27,28. يمكن أيضا قياس التيار الذي يتم تنشيطه بواسطة إزاحة شحنة الصباغ البصري في تسجيلات مشبك الجهد الكهربائي للخلية الكاملة29,30 (الشكل 5A-D) ، مع الميزة الرئيسية (في تسجيلات تيار المستقبلات المبكرة (ERC) لتقليل تأثير سعة الغشاء على حركية الإشارة.
يصف قسم البروتوكول كيفية إجراء قياسات ERG من قياسات ذبابة الفاكهة9 و ERC بواسطة تسجيلات الخلايا الكاملة من ذبابة الفاكهة المعزولة ommatidia31,32. كما نصف بروتوكولات محددة تستخدم للتحقيق في النقل الضوئي بشكل عام والأصباغ الضوئية بشكل خاص.
الميزة الرئيسية لاستخدام إعداد مستقبلات ذبابة الفاكهة الضوئية هي إمكانية الوصول إليها ، وسهولة ودقة التحفيز الضوئي ، والأهم من ذلك ، القدرة على تطبيق قوة علم الوراثة الجزيئية7. وقد أثبتت الدراسات الجينية المكثفة ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي مفيد للغاية للتشريح الجي?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا البحث من خلال منح من مؤسسة العلوم الإسرائيلية (ISF) ، ومؤسسة العلوم ثنائية القومية الأمريكية الإسرائيلية (BSF). ونشكر السيد أناتولي شابوتشنيكوف على بناء سخان خيوط الشمع.
1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
2 condenser lenses | |||
A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
Clampex | Molecular Device | Software | |
CO2 tank | |||
Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
pCLAMP | Molecular Device | Software | |
Petri dish | 60 mm | ||
Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |