Elektrofysiologiska metoder för mätning av fotopigmentnivåer i Drosophila Photoreceptors

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att elektrofysiologiskt karakterisera bistabila fotopigment: (i) utnyttja laddningsförskjutningarna inom fotopigmentmolekylerna efter fotonabsorption och deras enorma mängd i fotoreceptorerna, och (ii) utnyttja absorptionsspektraskillnaderna mellan rhodopsin och metarhodopsin fotopigmenttillstånd. Dessa protokoll är användbara för att screena för mutationer som påverkar bistabila fotopigmentsystem.

Abstract

Drosophila G-proteinkopplade fotopigmentet rhodopsin (R) består av ett protein (opsin) och en kromofor. Aktiveringsprocessen för rhodopsin initieras av fotonabsorptionsinducerande isomerisering av kromoforen, vilket främjar konformationsförändringar av opsin och resulterar i ett andra mörkstabilt fotopigmenttillstånd (metarhodopsin, M). Undersökning av detta bistabila fotopigment med slumpmässig mutagenes kräver enkla och robusta metoder för screening av mutanta flugor. Därför har flera metoder för att mäta minskningar av funktionella fotopigmentnivåer utformats. En sådan metod utnyttjar laddningsförskjutningarna i fotopigmentet efter fotonabsorption och de enorma mängder fotopigmentmolekyler som uttrycks i fotoreceptorerna. Denna elektriska signal, som kallas den tidiga receptorpotentialen (eller tidig receptorström), mäts med en mängd olika elektrofysiologiska metoder (t.ex. elektroretinogram och helcellsinspelningar) och är linjärt proportionell mot funktionella fotopigmentnivåer. Fördelarna med denna metod är det höga signal-brusförhållandet, direkt linjär mätning av fotopigmentnivåer och oberoende av fototransduktionsmekanismer nedströms till rhodopsin eller metarhodopsinaktivering. En ytterligare elektrofysiologisk metod som kallas långvarig depolariserande afterpotential (PDA) utnyttjar bistabiliteten hos Drosophila fotopigment och absorptionsspektrala skillnaderna mellan flug R- och M-pigmenttillstånd. PDA induceras av intensivt blått ljus, omvandlar mättande mängder rhodopsin till metarhodopsin, vilket resulterar i misslyckande av ljusresponsavslutning under en längre tid i mörker, men det kan avslutas med metarhodopsin till rhodopsinomvandling med intensivt orange ljus. Eftersom PDA är en robust signal som kräver massiv fotopigmentomvandling, leder även små defekter i fotopigmentets biogenes till lätt upptäckt onormal PDA. Faktum är att defekta PDA-mutanter ledde till identifiering av nya signalproteiner som är viktiga för fototransduktion.

Introduction

Det ljusaktiverade rhodopsinet (R), som är en G-proteinkopplad receptor (GPCR), består av ett 7 transmembranprotein (opsin) och en kromofor. I Drosophila melanogaster (fruktfluga) inducerar fotonabsorption isomerisering av 11-cis-3-OH-retinal kromofor till all-trans-3-OH-retinal ¹, vilket främjar konformationsförändringen av rhodopsin till metarhodopsin (M, figur 1A). Till skillnad från ryggradsdjur rhodopsin dissocierar inte den dominerande fraktionen av ryggradslösa djurkromofor från opsin, vilket resulterar i det fysiologiskt aktiva mörkstabila pigmenttillståndet M. I sin tur inducerar ytterligare fotonabsorption genom all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering av kromoforen ^2,3, vilket genererar R-pigmenttillståndet med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tillståndet är ett mörkt, stabilt och fysiologiskt icke-aktivt fotopigment. Förutom den extremt snabba fotonregenereringsvägen för kromofor⁴, ungefär som ryggradsdjursfotopigment, finns en alternativ enzymatisk långsam väg för kromoforregenerering hos ryggradslösa djur, där några av stadierna utförs i retinala celler som omger fotoreceptorcellerna ^5,6.

Drosophila medför stora fördelar som modellorganism för att studera ryggradslösa fotoreceptorer. I synnerhet har preparatets tillgänglighet och förmågan att tillämpa molekylär genetik gjort Drosophila till ett kraftfullt modellsystem⁷. Därför har flera in vivo– och ex vivo-experimentella metoder för att studera fototransduktion i allmänhet och fotopigmentnivåer i synnerhet fastställts. Den enklaste in vivo-metoden utnyttjar det relativt stora extracellulära inspelade spänningssvaret på ljus i Drosophila-ögat. Följaktligen framkallar ljusstimulering ett elektriskt spänningssvar i hela ögat som kan mätas med hjälp av extracellulär elektroretinograminspelning (ERG), vilket är ~ 3 storleksordningar större än ERG-svaret på ljus hos ryggradsdjurens ögon ^8,9. Drosophila ERG-svaret är robust och lätt att erhålla, vilket gör det till en bekväm metod för att identifiera avvikelser i ljusrespons på grund av mutationer. ERG-svaret på ljus härrör huvudsakligen från fotoreceptorerna, pigmentcellerna (glia) och sekundära neuroner i lamina (se figur 1B). Huvudkomponenterna i ERG är (i) fotoreceptorernas extracellulära spänningsrespons, (ii) “på” och “av” transienterna i början och slutet av ljusstimulansen som härrör från lamina-neuronerna (figur 2A, infälld, ON, OFF), (iii) det långsamma svaret från gliacellerna (figur 2A, infällning, pilar) och (iv) det korta och övergående svaret, till följd av laddningsförskjutning under aktivering av fotopigment som föregår ON-transienten¹⁰ (figur 2C [infälld], D, E). Detta korta svar består av två faser (M1 och M2, figur 2C [infälld]) och kan endast induceras genom extremt stark ljusstimulering, som samtidigt aktiverar miljontals fotopigmentmolekyler. Det observeras varken under blå stimulering (figur 2D, blått spår) eller hos mutanter med mycket reducerade fotopigmentnivåer (figur 2E, rött spår), men dess amplitud förbättras milt i en mutant som avskaffar PLC-aktivitet (figur 2E, orange spår). M1-fasen är en typisk ERP för flugan som härrör från aktiveringen av M i fotoreceptorerna. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulärt), frigör en neurotransmittor på normalt sätt i en teckeninverterande synaps och aktiverar lamina-neuronerna, som svarar på fotoreceptordepolariseringen genom att generera den synaptiskt förstärkta M2-fasen. Således återspeglar både M1- och M2-faserna M-aktivering^10,11.

Depolariseringen av fotoreceptorn genererar den hornhinnepositiva “på” -transienten, som härrör från den teckeninverterande synapsen mellan fotoreceptoraxonen och monopolarneuronerna i lamina^10,11 (Figur 1B). Den långsamma ökningen och sönderfallet av ERG härrör från depolariseringen av pigmentcellerna (figur 2A, infälld, pilar) främst på grund av K ⁺ efflux från fotoreceptorcellerna¹² via de övergående receptorpotentialen (TRP) och TRP-liknande (TRPL) kanaler 13,14,15. Dessa långsamma kinetiska komponenter maskerar och förvränger till stor del vågformen för fotoreceptorresponsen jämfört med intracellulära eller helcellsinspelningar av fotoreceptorns svar på ljus ^9,10. Vid mycket starka belysningar kan dessutom ett ytterligare transientsvar, som föregår och delvis smälter samman med “på”-transienten observeras (figur 2C [infälld],D,E). Denna signal härstammar direkt från den massiva aktiveringen av^{fotopigmentet 10}.

Flera ljusregimprotokoll som använder neutral densitet (ND) och färgfilter, samt starka lysande blixtar, har utvecklats för att undersöka ögat i allmänhet och fototransduktionskaskaden i synnerhet. Dessa protokoll har också använts för att undersöka egenskaperna hos fotopigmentet.

Intensitets-responsprotokollet mäter toppamplituden för ERG-spänningsresponsen för hela ögat till ökande ljusintensiteter (figur 2A,B). Detta protokoll hjälper till att upptäcka förändringar i fotoreceptorcellernas känslighet för ljus⁹.

Det långvariga depolariserande afterpotential -protokollet (PDA) utnyttjar skillnaderna i absorptionsspektra av rhodopsin och metarhodopsin som möjliggör, i Drosophila, en massiv fotopigmentomvandling av R till dess fysiologiskt aktiva och mörkstabila mellanliggande M-tillstånd². I ERG-spänningssvaret ges en relativt kort puls av mättande ljus och det resulterande spänningssvaret registreras. Under detta tillstånd uppnås ett tak (reverseringspotential) av depolariseringssignalen eftersom aktivering av en bråkdel av en procent av den enorma mängden rhodopsinmolekyler (~ 1 x 10⁸) är tillräcklig för att nå taket. Närvaron av fototransduktionskomponenterna i stort överflöd säkerställer att detta tak kommer att nås även i mutanter med en signifikant minskning av koncentrationen eller subtil funktionsfel hos fototransduktionskomponenterna. Denna situation utesluter isoleringen av dessa mutanter. introducerade PDA-screening⁷ och sökte ett pålitligt och avslöjande test för att isolera visuella mutanter. I Drosophila åstadkoms PDA-svaret genom att genetiskt avlägsna det röda screeningpigmentet, vilket möjliggör fotopigmentomvandling, och applicering av blått ljus, som företrädesvis absorberas av rhodopsin (figur 3A) och därmed resulterar i en stor nettoomvandling av R till M-fotopigmenttillståndet. Fototransduktionsavslutning störs vid fotopigmentets nivå av en stor nettoomvandling av R till M, vilket i sin tur resulterar i ihållande excitation långt efter att ljuset har stängts av (figur 2C, figur 4A [överst]). Under PDA-perioden är fotoreceptorerna mindre känsliga för efterföljande testljus och är delvis desensibiliserade (inaktiverade). PDA upptäcker även mindre defekter i rhodopsinbiogenes och testar fotoreceptorcellens maximala kapacitet för att upprätthålla excitation under en längre period. Eftersom det strikt beror på närvaron av höga koncentrationer av rhodopsin, gör det lätt poäng för bristfällig påfyllning av fototransduktionskomponenterna. Anmärkningsvärt nog har PDA-skärmen gett många nya och mycket viktiga visuella mutanter (granskade i Pak et ^al.7). Således är PDA-mutanterna isolerade av Pak et ^al.7 fortfarande extremt användbara för att analysera det drosophila visuella systemet.

PDA induceras i Drosophila genom att mätta blått ljus, vilket resulterar i kontinuerlig depolarisering långt efter ljusförskjutning (figur 4A [överst]). Efter att ha mättat PDA-inducerande blått ljus förblir de perifera fotoreceptorerna (R1-6) kontinuerligt aktiva i mörkret med sin maximala kapacitet och når mättnad. Ytterligare mättande blåljus under handdatorn ger inget ytterligare svar i R1-6-celler på många sekunder utan inducerar ett svar i R7-8-celler som läggs ovanpå handdatorn. De överlagrade svaren förklaras av de olika absorptionsspektra av fotopigmenten uttryckta i dessa celler (R7-8)¹⁶. Handdatorn kan undertryckas genom fotokonvertering av M tillbaka till R med mättande orange ljus (figur 4A [överst]). Handdatorns förmåga att föra fotoreceptorcellerna till sin maximala aktiva kapacitet, en situation som inte kan uppnås med intensivt vitt ljus, förklarar varför det har varit ett viktigt verktyg för att screena för visuella mutanter av Drosophila. Detta beror på att det möjliggör detektering av även mindre defekter i proteiner som är involverade i biogenesen av normala fotopigmentnivåer^17,18. Två grupper av defekta PDA-mutanter har isolerats: varken inaktivering eller efterpotential (nina) mutanter och inaktivering men inte efterpotential (ina) mutanter. Fenotypen för den förra är en brist på en PDA och tillhörande inaktivering som härrör från en stor minskning av fotopigmentnivåerna (figur 4A [mitten]). Fenotypen för den senare visar inaktivering men ingen mörk depolarisering efter blått ljus på grund av en fortfarande okänd mekanism i mutanten med normala rhodopsinnivåer men saknar proteiner som interagerar med TRP-kanalerna (figur 4A [botten]).

PDA uppstår från skillnaden i mängden fotopigment i förhållande till arrestin (ARR2), som binder och avslutar M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila-fotoreceptorer är mängden fotopigment ungefär femfaldigt större än mängden ARR2¹⁹. Således är ARR2-nivåerna otillräckliga för att inaktivera alla M-molekyler som genereras av en stor nettofotokonvertering av R till M, vilket lämnar ett överskott av M ständigt aktivt i mörkret 17,19,20,22,23. Denna mekanism förklarar elimineringen av PDA-svaret genom mutationer eller genom karotenoid deprivation^24,25, vilket orsakar en minskning av fotopigmentnivån, men påverkar inte arrestinnivåerna. Dessutom står denna förklaring också för fenotyperna av noll ARR2 (arr2³) mutant allel²¹, där PDA kan uppnås vid ~ 10 gånger dimmerblå ljusintensiteter 19,20,21 (figur 4B, C). PDA är inte en unik egenskap hos flugfotoreceptorer, och den förekommer i alla testade arter som har mörk stabil M med ett absorptionsspektrum som skiljer sig från R-tillståndet, vilket möjliggör tillräcklig fotokonvertering av fotopigmentet från R till M-tillståndet. En grundligt undersökt art där PDA-fenomenologin upptäcktes är barnacle (Balanus) fotoreceptor, där absorptionsspektrumet för R-tillståndet är i en längre våglängd än M-tillståndet² (Figur 3B). Följaktligen, till skillnad från situationen i flugan, i havstulpanen, inducerar orange-rött ljus en PDA, medan blått ljus undertrycker PDA².

Det tidiga receptorpotentialprotokollet (ERP) utnyttjar laddningsförskjutningen som uppstår under R- eller M-aktivering. Det visuella pigmentet är en integrerad del av ytmembranet i signalfacket hos både ryggradsdjur och ryggradslösa membran³. Följaktligen åtföljs aktiveringsprocessen i vilken fotopigmentmolekylerna förändras från ett mellanliggande tillstånd till nästa av en laddningsförskjutning ^4,26. Eftersom fotopigmentmolekylerna är elektriskt inriktade parallellt med membrankapacitansen⁴, genererar en snabb synkroniserad konformationsförändring en snabb polarisationsförändring av ytmembranet, som hos flugor sker i signalfacket som består av en stapel av ~ 30 000-50 000 mikrovilli som kallas rabdomere. Denna polarisation släpps sedan passivt genom cellkroppens membrankapacitans tills cellmembranet är lika polariserat. ERP är den extracellulära registreringen av laddningsförskjutningen. Den intracellulärt inspelade ERP manifesterar den extracellulära ERP integrerad av tidskonstanten för cellmembranet ^4,27,28. Strömmen som aktiveras av den visuella pigmentladdningsförskjutningen kan också mätas i helcellsspänningskläminspelningar^29,30 (figur 5A-D), med den stora fördelen (i tidiga receptorströminspelningar (ERC) att minimera effekten av membrankapacitans på signalens kinetik.

Protokollavsnittet beskriver hur man utför ERG-mätningar från Drosophila eye⁹ och ERC-mätningar med helcellsinspelningar från Drosophila isolerade ommatidia^31,32. Vi beskriver också specifika protokoll som används för att undersöka fototransduktion i allmänhet och fotopigment i synnerhet.

Protocol

1. Mätning av intensitetsresponsförhållandet, långvarig depolariserande efterpotential (PDA) och den tidiga receptorpotentialen (ERP) med hjälp av elektroretinogrammet Lämpliga uppfödningsförhållanden för beredning av D. melanogaster Höj D. melanogasterflugor i flaskor som innehåller standard gul majs som innehåller mat i en inkubator som hålls vid en temperatur av 24 ° C och i en 12 h mörk / ljus cykel Håll flugflaskorna i mörker minst 24 …

Representative Results

Figur 2 exemplifierar robustheten och lättheten i att använda ERG-tekniken. Den är robust eftersom den registreras i den praktiskt taget intakta flugan med en enkel teknik för extracellulära spänningsinspelningar som kräver en enkel elektrofysiologisk inställning. Robustheten manifesteras genom att erhålla inspelningar av ljussvar med relativt stora amplituder (i millivoltområdet) även när mutationer kraftigt minskar eller snedvrider ljusresponsen. Därför kan även en oerfaren …

Discussion

Den största fördelen med att använda Drosophila-fotoreceptorpreparatet är dess tillgänglighet, lättheten och noggrannheten i ljusstimulering och, viktigast av allt, förmågan att tillämpa kraften i molekylär genetik⁷. Omfattande genetiska studier har etablerat Drosophila som ett extremt användbart modellsystem för genetisk dissektion av komplexa biologiska processer⁷. Den relativt enkla strukturen hos Drosophila -genomet (bestående av …

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X