Elektrofysiologiske metoder til måling af fotopigmentniveauer i Drosophila Photoreceptorer

Summary

Vi præsenterer en protokol til elektrofysiologisk at karakterisere bi-stabile fotopigmenter: (i) udnyttelse af ladningsforskydningerne i fotopigmentmolekylerne efter fotonabsorption og deres enorme mængde i fotoreceptorerne og (ii) udnyttelse af absorptionsspektreforskellene mellem rhodopsin og metarhodopsinfotopigmenttilstande. Disse protokoller er nyttige til at screene for mutationer, der påvirker bi-stabile fotopigmentsystemer.

Abstract

Drosophila G-proteinkoblet fotopigment rhodopsin (R) består af et protein (opsin) og en kromofor. Aktiveringsprocessen af rhodopsin initieres af fotonabsorptionsfremkaldende isomerisering af kromoforen, hvilket fremmer konformationsændringer af opsin og resulterer i en anden mørk stabil fotopigmenttilstand (metarhodopsin, M). Undersøgelse af denne bi-stabile fotopigment ved hjælp af tilfældig mutagenese kræver enkle og robuste metoder til screening af mutante fluer. Derfor er der designet flere metoder til måling af reduktioner i funktionelle fotopigmentniveauer. En sådan metode udnytter ladningsforskydningerne i fotopigmentet efter fotonabsorption og de enorme mængder fotopigmentmolekyler udtrykt i fotoreceptorerne. Dette elektriske signal, kaldet det tidlige receptorpotentiale (eller tidlig receptorstrøm), måles ved en række elektrofysiologiske metoder (f.eks. Elektroretinogram og helcelleoptagelser) og er lineært proportional med funktionelle fotopigmentniveauer. Fordelene ved denne metode er det høje signal-støj-forhold, direkte lineær måling af fotopigmentniveauer og uafhængighed af fototransduktionsmekanismer nedstrøms til rhodopsin- eller metarhodopsinaktivering. En yderligere elektrofysiologisk metode kaldet langvarig depolarisering efterpotentiel (PDA) udnytter bi-stabiliteten af Drosophila fotopigment og absorptionsspektrale forskelle mellem flue R og M pigmenttilstande. PDA’en induceres af intenst blåt lys, der omdanner mættede mængder rhodopsin til metarhodopsin, hvilket resulterer i svigt i lysresponsafslutning i længere tid i mørke, men det kan afsluttes ved metarhodopsin til rhodopsinkonvertering ved hjælp af intens orange lys. Da PDA’en er et robust signal, der kræver massiv fotopigmentkonvertering, fører selv små defekter i biogenesen af fotopigmentet til let detekteret unormal PDA. Faktisk førte defekte PDA-mutanter til identifikation af nye signalproteiner, der var vigtige for fototransduktion.

Introduction

Den lysaktiverede rhodopsin (R), som er en G-proteinkoblet receptor (GPCR), består af et 7 transmembranprotein (opsin) og en kromofor. I Drosophila melanogaster (frugtflue) inducerer fotonabsorption isomerisering af 11-cis-3-OH-retinal kromofor til all-trans-3-OH-retinal¹, hvilket fremmer den konformationelle ændring af rhodopsin til metarhodopsin (M, figur 1A). I modsætning til hvirveldyr rhodopsin dissocieres den overvejende fraktion af invertebratchromophore ikke fra opsinen, hvilket resulterer i den fysiologisk aktive mørkstabile pigmenttilstand M. Til gengæld inducerer yderligere fotonabsorption af all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering af kromoforen ^2,3, hvilket genererer R-pigmenttilstanden med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tilstanden er en mørk, stabil og fysiologisk ikke-aktiv fotopigment. Ud over den ekstremt hurtige fotonregenereringsrute for^{kromoforen 4}, ligesom hvirveldyrfotopigmenter, findes der en alternativ enzymatisk langsom rute til kromoforregenerering hos hvirvelløse dyr, hvor nogle af stadierne udføres i retinale celler omkring fotoreceptorcellerne ^5,6.

Drosophila medfører store fordele som en modelorganisme til undersøgelse af hvirvelløse fotoreceptorer. Især præparatets tilgængelighed og evnen til at anvende molekylær genetik har gjort Drosophila til et kraftfuldt modelsystem⁷. Derfor er der etableret flere in vivo– og ex vivo-eksperimentelle metoder til undersøgelse af fototransduktion generelt og fotopigmentniveauer i særdeleshed. Den enkleste in-vivo-metode udnytter den relativt store ekstracellulært registrerede spændingsrespons på lyset i Drosophila-øjet. Følgelig fremkalder lysstimulering et elektrisk spændingsrespons i hele øjet, der kan måles ved hjælp af ekstracellulær elektroretinogram (ERG) optagelse, hvilket er ~ 3 størrelsesordener større end ERG-responsen på lys fra hvirveldyr øjne ^8,9. Drosophila ERG-responsen er robust og let opnået, hvilket gør det til en bekvem metode til at identificere abnormiteter i lysrespons på grund af mutationer. ERG-responsen på lys stammer hovedsageligt fra fotoreceptorerne, pigmentcellerne (glia) og sekundære neuroner i laminaen (se figur 1B). Hovedkomponenterne i ERG er (i) fotoreceptorernes ekstracellulære spændingsrespons, (ii) “on” og “off” transienterne i begyndelsen og slutningen af lysstimuleringen, der opstår fra lamina neuronerne (figur 2A, indsat, ON, OFF), (iii) den langsomme respons af gliacellerne (figur 2A, indsats, pile) og (iv) den korte og forbigående respons, som følge af ladningsforskydning under fotopigmentaktivering, der går forud for ON transient¹⁰ (figur 2C [indsat], D, E). Dette korte respons består af to faser (M1 og M2, figur 2C [indsat]) og kan kun induceres ved ekstremt stærk lysstimulering, som samtidig aktiverer millioner af fotopigmentmolekyler. Det observeres hverken under blå stimulering (figur 2D, blåt spor) eller hos mutanter med stærkt reducerede fotopigmentniveauer (figur 2E, rødt spor), men dets amplitude er mildt forbedret i en mutant, der afskaffer PLC-aktivitet (figur 2E, orange spor). M1-fasen er en typisk ERP af fluen som følge af aktiveringen af M i fotoreceptorerne. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulært), frigiver en neurotransmitter på normal måde i en tegninverterende synapse og aktiverer lamina neuronerne, som reagerer på fotoreceptordepolariseringen ved at generere den synaptisk forstærkede M2-fase. Således afspejler både M1- og M2-faser M-aktivering^10,11.

Depolariseringen af fotoreceptoren genererer den hornhinde-positive “on” forbigående, der stammer fra den tegninverterende synapse mellem fotoreceptor axon og de monopolære neuroner i lamina^10,11 (figur 1B). Den langsomme stigning og henfald af ERG stammer fra depolariseringen af pigmentcellerne (figur 2A, indsat, pile) hovedsageligt på grund af K ⁺ -udstrømning fra fotoreceptorcellerne¹² via det forbigående receptorpotentiale (TRP) og TRP-lignende (TRPL) kanaler 13,14,15. Disse langsomme kinetiske komponenter maskerer og forvrænger i vid udstrækning bølgeformen af fotoreceptorsponset sammenlignet med intracellulære eller helcelleoptagelser af fotoreceptorresponset på lys ^9,10. Derudover kan der ved meget stærke belysninger observeres en yderligere forbigående respons, som går forud for og delvis smelter sammen med den “tændte” transient (figur 2C [indsat], D, E). Dette signal stammer direkte fra den massive aktivering af fotopigmentet¹⁰.

Flere lysregimeprotokoller ved hjælp af neutral densitet (ND) og farvefiltre samt stærke lysende blink er blevet udviklet til at undersøge øjet generelt og fototransduktionskaskaden i særdeleshed. Disse protokoller er også blevet brugt til at undersøge fotopigmentets egenskaber.

Intensitetsresponsprotokollen måler topamplituden af ERG-spændingsresponsen for hele øjet til stigende lysintensiteter (figur 2A, B). Denne protokol hjælper med at detektere ændringer i fotoreceptorcellernes følsomhed over for lys⁹.

Den langvarige depolariserende efterpotentielle (PDA) protokol udnytter forskellene i absorptionsspektrene af rhodopsin og metarhodopsin, der i Drosophila tillader en massiv fotopigmentkonvertering af R til dens fysiologisk aktive og mørkstabile mellemliggende M-tilstand². I ERG-spændingsresponsen gives en relativt kort puls af mættet lys, og det resulterende spændingsrespons registreres. Under denne betingelse nås et loft (reverseringspotentiale) af depolariseringssignalet, fordi aktivering af en brøkdel af en procent af den enorme mængde rhodopsinmolekyler (~ 1 x 10⁸) er tilstrækkelig til at nå loftet. Tilstedeværelsen af fototransduktionskomponenterne i stor overflod sikrer, at dette loft nås selv i mutanter med en betydelig reduktion i koncentration eller subtil funktionsfejl i fototransduktionskomponenterne. Denne situation udelukker isolering af disse mutanter. Pak et al. introducerede PDA-screening⁷ , der søgte en pålidelig og afslørende test for at isolere visuelle mutanter. I Drosophila tilvejebringes PDA-responset ved genetisk fjernelse af det røde screeningspigment, som muliggør fotopigmentkonvertering, og påføring af blåt lys, som fortrinsvis absorberes af rhodopsin (figur 3A) og dermed resulterer i en stor nettokonvertering af R til M-fotopigmenttilstanden. Fototransduktionsafslutning forstyrres på fotopigmentniveau ved en stor nettokonvertering af R til M, hvilket igen resulterer i vedvarende excitation længe efter, at lyset er slukket (figur 2C, figur 4A [øverst]). I PDA-perioden er fotoreceptorerne mindre følsomme over for efterfølgende testlys og er delvist desensibiliserede (inaktiverede). PDA’en detekterer selv mindre defekter i rhodopsin biogenese og tester fotoreceptorcellens maksimale kapacitet til at opretholde excitation i en længere periode. Da det strengt afhænger af tilstedeværelsen af høje koncentrationer af rhodopsin, scorer det let for mangelfuld genopfyldning af fototransduktionskomponenterne. Bemærkelsesværdigt har PDA-skærmen givet mange nye og meget vigtige visuelle mutanter (gennemgået i Pak et ^al.7). Således er PDA-mutanterne isoleret af Pak et ^al.7 stadig yderst nyttige til analyse af Drosophila visuelle system.

PDA’en induceres i Drosophila ved at mætte blåt lys, hvilket resulterer i kontinuerlig depolarisering længe efter lysforskydning (figur 4A [øverst]). Efter mætning af PDA-inducerende blåt lys forbliver de perifere fotoreceptorer (R1-6) kontinuerligt aktive i mørket ved deres maksimale kapacitet og når mætning. Yderligere mættende blå lys under PDA’en producerer ikke yderligere respons i R1-6-celler i mange sekunder, men inducerer et respons i R7-8-celler, der er overlejret på PDA’en. De overlejrede reaktioner forklares af de forskellige absorptionsspektre af fotopigmenterne udtrykt i disse celler (R7-8)¹⁶. PDA’en kan undertrykkes ved fotokonvertering af M tilbage til R med mættet orange lys (figur 4A [øverst]). PDA’ens evne til at bringe fotoreceptorcellerne til deres maksimale aktive kapacitet, en situation, der ikke kan opnås ved intenst hvidt lys, forklarer, hvorfor det har været et vigtigt værktøj til at screene for visuelle mutanter af Drosophila. Dette skyldes, at det tillader påvisning af selv mindre defekter i proteiner involveret i biogenesen af normale fotopigmentniveauer ^17,18. To grupper af PDA defekte mutanter er blevet isoleret: hverken inaktivering eller efterpotentielle (nina) mutanter og inaktivering, men ikke efterpotentielle (ina) mutanter. Fænotypen af førstnævnte er mangel på en PDA og den tilhørende inaktivering som følge af en stor reduktion i fotopigmentniveauerne (figur 4A [midten]). Fænotypen af sidstnævnte viser inaktivering, men ingen mørk depolarisering efter blåt lys på grund af en stadig ukendt mekanisme i mutanten med normale rhodopsinniveauer, men mangler proteiner, der interagerer med TRP-kanalerne (figur 4A [bund]).

PDA’en stammer fra forskellen i mængden af fotopigment i forhold til arrestin (ARR2), som binder og afslutter M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila fotoreceptorer er mængden af fotopigment ca. fem gange større end mængden af ARR2¹⁹. ARR2-niveauer er således utilstrækkelige til at inaktivere alle M-molekyler genereret af en stor nettofotokonvertering af R til M, hvilket efterlader et overskud af M konstant aktiv i^mørket 17,19,20,22,23. Denne mekanisme forklarer eliminering af PDA-responsen ved mutationer eller ved carotenoid deprivation^24,25, hvilket forårsager en reduktion i fotopigmentniveauet, men påvirker ikke arrestinniveauerne. Desuden tegner denne forklaring sig også for fænotyperne af null ARR2 (arr2³) mutant allel²¹, hvor PDA kunne opnås ved ~ 10 gange svagere blå lysintensiteter 19,20,21 (figur 4B, C). PDA’en er ikke et unikt træk ved fluefotoreceptorer, og den forekommer i alle testede arter, der har mørk stabil M med et absorptionsspektrum, der adskiller sig fra R-tilstanden, hvilket muliggør tilstrækkelig fotokonvertering af fotopigmentet fra R til M-tilstand. En grundigt undersøgt art, hvor PDA-fænomenologien blev opdaget, er barnacle (Balanus) fotoreceptoren, hvor absorptionsspektret for R-tilstanden er i en længere bølgelængde end M-tilstanden² (figur 3B). I modsætning til situationen i fluen inducerer orangerødt lys i ruren derfor en PDA, mens blåt lys undertrykker PDA².

Erp-protokollen (Early Receptor Potential) udnytter den ladningsforskydning, der forekommer under R- eller M-aktivering. Det visuelle pigment er en integreret del af overflademembranen i signalrummet i både hvirveldyr og hvirvelløse membraner³. Følgelig ledsages aktiveringsprocessen, hvor fotopigmentmolekylerne ændres fra en mellemtilstand til den næste, af en ladningsforskydning ^4,26. Da fotopigmentmolekylerne er elektrisk justeret parallelt med membrankapacitansen⁴, genererer en hurtig synkroniseret konformationsændring en hurtig polarisationsændring af overflademembranen, som i fluer forekommer i signalrummet sammensat af en stak på ~ 30.000-50.000 mikrovilli kaldet rhabdomere. Denne polarisering udledes derefter passivt gennem cellelegemets membrankapacitans, indtil cellemembranen er lige polariseret. ERP er den ekstracellulære registrering af ladningsforskydningen. Den intracellulært registrerede ERP manifesterer den ekstracellulære ERP integreret af cellemembranens tidskonstant ^4,27,28. Den strøm, der aktiveres af den visuelle pigmentladningsforskydning, kunne også måles i helcellespændingsklemmeoptagelser^29,30 (figur 5A-D) med den største fordel (i tidlige receptorstrømoptagelser (ERC) ved at minimere effekten af membrankapacitans på signalets kinetik.

Protokolafsnittet beskriver, hvordan man udfører ERG-målinger fra Drosophila eye⁹ og ERC-målinger ved helcelleoptagelser fra Drosophila isoleret ommatidia^31,32. Vi beskriver også specifikke protokoller, der bruges til at undersøge fototransduktion generelt og fotopigmenter i særdeleshed.

Protocol

1. Måling af intensitetsresponsforholdet, langvarig depolarisering efterpotentiel (PDA) og det tidlige receptorpotentiale (ERP) ved hjælp af elektroretinogrammet Egnede opdrætsbetingelser for forberedelse af D. melanogaster Raise D. melanogaster flyver i flasker indeholdende standard gul majs indeholdende mad i en inkubator, der holdes ved en temperatur på 24 ° C og i en 12 timers mørk / lys cyklus Hold flueflaskerne i mørke mindst 24 timer før ekspe…

Representative Results

Figur 2 eksemplificerer robustheden og letheden ved at bruge ERG-teknikken. Det er robust, fordi det registreres i den næsten intakte flue ved hjælp af en simpel teknik med ekstracellulære spændingsoptagelser, der kræver en simpel elektrofysiologisk opsætning. Robustheden manifesteres ved at opnå optagelser af lysresponser med relativt store amplituder (i millivoltområdet), selv når mutationer kraftigt reducerer eller forvrænger lysresponsen. Derfor kan selv en uerfaren eksperiment…

Discussion

Den største fordel ved at bruge Drosophila fotoreceptorpræparatet er dets tilgængelighed, lethed og nøjagtighed af lysstimulering og vigtigst af alt evnen til at anvende kraften i molekylær genetik⁷. Omfattende genetiske undersøgelser har etableret Drosophila som et yderst nyttigt modelsystem til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer⁷. Den relativt enkle struktur af Drosophila-genomet (bestående af kun fire kromosomer, herun…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X