Hedefler Altında Ultra Düşük Giriş Bölünmesi ve Nükleaz Kullanarak Salınım Kullanılarak Kromatin Üzerinde Tek Hücreli Faktör Lokalizasyonu
Summary
CUT&RUN ve varyantları, kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için kullanılabilir. Bu protokol, tek hücreli uliCUT&RUN kullanarak kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun nasıl belirleneceğini açıklar.
Abstract
Bir proteinin kromatin üzerindeki bağlanma yerlerinin belirlenmesi, işlevini ve potansiyel düzenleyici hedeflerini anlamak için gereklidir. Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), 30 yılı aşkın bir süredir protein lokalizasyonunu belirlemek için altın standart olmuştur ve ilgilenilen proteini sonikleştirilmiş veya enzimatik olarak sindirilmiş kromatinden çıkarmak için bir antikor kullanımı ile tanımlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, antikor bağlama teknikleri, artan duyarlılıkları nedeniyle kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu değerlendirmek için popüler hale gelmiştir. Nükleaz Altında Hedefler Altında Bölünme ve Salınım (CUT&RUN), Kromatin İmmünoklevajının (ChIC) genom çapında türevidir ve ilgilenilen bir proteini hedefleyen antikorun IgG sabit bölgesini tanımlamak için mikrokokal nükleaza (pA-MNase) bağlı rekombinant Protein A’yı kullanır, bu nedenle ilgilenilen proteini çevreleyen DNA’nın bölgeye özgü bölünmesini sağlar. CUT&RUN, histon modifikasyonlarını, transkripsiyon faktörlerini ve nükleozom yeniden şekillendirme faktörleri gibi diğer kromatin bağlayıcı proteinleri profillemek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, CUT&RUN, ökromatik veya heterokromatik ilişkili proteinlerin ve histon modifikasyonlarının lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu nedenlerden dolayı, CUT&RUN çok çeşitli proteinlerin bağlanma profillerini belirlemek için güçlü bir yöntemdir. Son zamanlarda, CUT&RUN, düşük hücre popülasyonlarında ve tek hücrelerde transkripsiyon faktörü profillemesi için optimize edilmiştir ve optimize edilmiş protokol ultra düşük girişli CUT&RUN (uliCUT&RUN) olarak adlandırılmıştır. Burada, uliCUT & RUN kullanılarak manuel 96 kuyucuklu bir biçimde tek hücreli faktör profili oluşturma için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Introduction
Birçok nükleer protein, DNA şablonlu aktiviteleri teşvik etmek veya önlemek için kromatin ile etkileşime girerek işlev görür. Bu kromatin etkileşiminde bulunan proteinlerin işlevini belirlemek için, bu proteinlerin bağlandığı genomik yerleri tanımlamak önemlidir. 1985 yılında geliştirilmesinden bu yana, Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP), bir proteinin kromatin 1,2’ye nerede bağlandığını belirlemek için altın standart olmuştur. Geleneksel ChIP tekniği aşağıdaki temel iş akışına sahiptir: hücreler toplanır ve çapraz bağlanır (genellikle formaldehit ile), kromatin kesilir (genellikle çapraz bağlama gerektiren sert sonikasyon yöntemleriyle), ilgilenilen protein, proteini (veya etiketli proteini) hedef alan bir antikor kullanılarak immünopreprepite edilir, ardından ikincil bir antikor (agaroz veya manyetik boncuklara bağlanmış), çapraz bağlama tersine çevrilir, DNA’yı saflaştırmak için protein ve RNA sindirilir ve bu ChIP ile zenginleştirilmiş DNA, analiz için şablon olarak kullanılır (radyoetiketli problar1,2, qPCR3, mikrodiziler 5,6 veya dizileme4 kullanılarak). Mikrodizilerin ortaya çıkması ve büyük ölçüde paralel derin dizilemeyle birlikte, ChIP-çip 5,6 ve ChIP-seq4 daha yakın zamanda geliştirilmiştir ve kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunun genom çapında tanımlanmasına izin vermektedir. ChIP’yi çapraz bağlamak, ChIP-exo7 ve ChIP-nexus8 tarafından çözünürlükte büyük ilerlemelerle ortaya çıkmasından bu yana güçlü ve güvenilir bir teknik olmuştur. ChIP-seq’in geliştirilmesine paralel olarak, geleneksel çapraz bağlama ChIP tekniklerinde gerçekleştirilen sonikasyonun aksine, kromatini parçalamak için nükleaz sindirimini (genellikle mikrokokal nükleaz veya MNaz kullanarak) kullanan ChIP (N-ChIP) için doğal (çapraz bağlanmayan) protokoller kurulmuştur9. Bununla birlikte, hem çapraz bağlanma ChIP hem de N-ChIP teknolojilerinin en büyük dezavantajlarından biri, deneysel manipülasyonu takiben düşük DNA verimi nedeniyle yüksek hücre sayılarına duyulan gereksinim olmuştur. Bu nedenle, son yıllarda, ChIP teknolojilerini düşük hücre girişi için optimize etmeye yönelik birçok çaba sarf edilmiştir. Bu çabalar, uygulanabilirlikleri ve girdi gereksinimleri10,11,12,13,14,15,16,17,18 olarak değişen birçok güçlü ChIP tabanlı teknolojinin geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, tek hücreli ChIP-seq tabanlı teknolojiler, özellikle histon olmayan proteinler için eksiktir.
2004 yılında, Kromatin Endojen Bölünme (ChEC) ve Kromatin İmmün Kemebölünme (ChIC)19 olarak adlandırılan kromatin üzerindeki protein doluluğunu belirlemek için alternatif bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu tek lokus teknikleri, ilgilenilen proteine bitişik DNA’nın doğrudan kesilmesi için MNaz’ın ilgilenilen proteine (ChEC) veya protein A’ya (ChIC) füzyonunu kullanır. Daha yakın yıllarda, hem ChEC hem de ChIC, kromatin (sırasıyla ChEC-seq ve CUT&RUN) üzerinde genom çapında protein profillemesi için optimize edilmiştir 20,21. ChEC-seq, faktör lokalizasyonunu belirlemek için güçlü bir teknik olsa da, her hedef için MNaz-füzyon proteinlerinin geliştirilmesini gerektirirken, ChIC ve genom çapındaki varyasyonu CUT&RUN, ilgilenilen proteine (ChIP’de olduğu gibi) ve Protein A’nın antikorun IgG sabit bölgesini tanıyabildiği rekombinant Protein A-MNaz’a yönelik bir antikora güvenir. Alternatif olarak, daha geniş bir yelpazedeki antikor sabit bölgelerini tanıyabilen bir füzyon Protein A / Protein G-MNaz (pA / G-MNaz) geliştirilmiştir22. CUT&RUN, kromatin genomu genelinde protein lokalizasyonunu belirlemek için hızla ChIP-seq’e popüler bir alternatif haline gelmiştir.
Düşük ve tek hücreli girişlerin kullanılmasını sağlayan bir CUT&RUN varyasyonu olan ultra düşük girişli CUT&RUN (ULICUT&RUN), 201923 yılında açıklanmıştır. Burada, manuel 96 delikli formatta tek hücreli bir uygulamanın metodolojisi açıklanmaktadır. uliCUT&RUN’un geliştirilmesinden bu yana, histon profillemesi için iki alternatifin, CUT&Tag ve iACT-seq’in geliştirildiğini ve histon proteinlerinin sağlam ve oldukça paralel profillenmesini sağladığını belirtmek önemlidir24,25. Ayrıca, scCUT&Tag, tek bir hücrede (multiCUT&Tag) birden fazla faktörün profilini çıkarmak ve histon olmayan proteinlere uygulama için optimize edilmiştir26. Birlikte, CUT&RUN, uliCUT&RUN’un bir hücre ayıklayıcıya ve standart ekipmana erişimi olan herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında gerçekleştirilebildiği düşük girişli ChIP-seq’e çekici bir alternatif sunar.
Protocol
Representative Results
Discussion
CUT&RUN, kromatin üzerindeki protein lokalizasyonunu belirlemek için etkili bir protokoldür. Diğer protokollere göre birçok avantajı vardır: 1) yüksek sinyal-gürültü oranı, 2) hızlı protokol ve 3) düşük sıralama okuma kapsamı gerekli ve böylece maliyet tasarrufuna yol açar. Protein A- veya Protein A/G-MNaz kullanımı, CUT&RUN’un mevcut herhangi bir antikor ile uygulanmasını sağlar; bu nedenle, birçok proteinin profilini hızlı ve kolay bir şekilde çıkarma potansiyeline sahiptir. Bununla bir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hainer Lab üyelerine bu makalenin önceki bir versiyonunu okudukları ve yorumladıkları için teşekkür ederiz. Bu proje, Pittsburgh Üniversitesi Sağlık Bilimleri Sıralama Çekirdeği’nde bulunan NextSeq500’ü, Pittsburgh Çocuk Hastanesi’ndeki UPMC Çocuk Hastanesi’nde, direktörü William MacDonald’a özel teşekkürlerle sıralamak için kullandı. Bu araştırma kısmen Pittsburgh Üniversitesi Araştırma Hesaplama Merkezi tarafından sağlanan bilgisayar kaynakları aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe Numarası R35GM133732 (S.J.H.’ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1.5 mL clear microfuge tubes | ThermoFisher Scientific | 90410 | |
| 1.5 mL tube magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | |
| 1.5 mL tube-compatible cold centrifuge | Eppendorf | 5404000537 | |
| 10 cm sterile tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 150464 | |
| 10X T4 DNA Ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 89039-656 | |
| 1X TE buffer | ThermoFisher Scientific | 12090015 | |
| 200 µL PCR tubes | Eppendorf | 951010022 | |
| 2X quick ligase buffer | New England Biolabs | M2200 | Ligase Buffer |
| 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | 5X high fidelity PCR buffer |
| 7-Amino-Actinomycin D (7-AAD) | Fisher Scientific | BDB559925 | |
| 96-well magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12027 or 12331D | |
| 96-well plate | VWR | 82006-636 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | polystyrene-magnetite beads; Due to potential variability between AMPure XP bead lots, it is recommended that your AMPure bead solution be calibrated. See manufacturer’s instructions |
| Antibody to protein of interest | varies | ||
| ATP | ThermoFisher Scientific | R0441 | |
| BioMag Plus Concanavalin A beads | Polysciences | 86057-10 | ConA-conjugated paramagnetic microspheres |
| BSA | |||
| Calcium Chloride (CaCl2) | Fisher Scientific | AAJ62905AP | |
| Cell sorter | BD FACSAria II cell sorter | Requires training | |
| Cell-specific media for cell culture | Varies | ||
| Chloroform | ThermoFisher Scientific | C298-500 | Chloroform is a skin irritant and harmful if swallowed; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Computer with 64-bit processer and access to a super computing cluster | For computational analyses of resulting sequencing datasets | ||
| DNA spin columns | Epoch Life Sciences | 1920-250 | |
| dNTP set | New England Biolabs | N0446S | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Electrophoresis equipment | varies | ||
| Ethanol | Fisher Scientific | 22032601 | 100% vol/vol ethanol is highly flammable; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP2482100 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycogen | VWR | 97063-256 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Heterologous S. cerevisiae DNA spike-in | homemade | Prepared from crosslinked, MNase-digested, and agarose gel extracted genomic DNA purified of protein/RNA and diluted to 10 ng/mL. We recommend yeast genomic DNA, but other organisms can be used if needed. | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | Hydrochloric Acid is very corrosive; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Ice Bucket | varies | ||
| Illumina Sequencing platform (e.g., NextSeq500) | Illumina | ||
| Incubator with temperature and atmosphere control | ThermoFisher Scientific | 51030284 | |
| KAPA HotStart HiFi DNA Polymerase with 5X KAPA HiFi buffer | Roche | 7958889001 | hotstart high fidelity polymerase |
| Laminar flow hood | Bakery Company | SG404 | |
| Manganese Chloride (MnCl2) | Sigma Aldrich | 244589 | |
| Micropipette set | Rainin | 30386597 | |
| Minifuge | Benchmark Scientific | C1012 | |
| NEB Adaptor | New England Biolabs | E6612AVIAL | Adaptor |
| NEB Universal primer | New England Biolabs | E6611AVIAL | Universal Primer |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina kit | New England Biolabs | E7335S/L, E7500S/L, E7710S/L, E7730S/L | Indexed Primers |
| Negative control antibody | Antibodies-Online | ABIN101961 | |
| Nuclease Free water | New England Biolabs | B1500S | |
| PCR thermocycler | Eppendorf | 2231000666 | |
| Phase lock tubes | Qiagen | 129046 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (PCI) | ThermoFisher Scientific | 15593049 | Phenol is harmful if swallowed or upon skin contact; handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Phsophate buffered saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10814010 | |
| Pipette aid | Drummond Scientific | # 4-000-100 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 4000 | VWR | A16151 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma Aldrich | P3911 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250-1 | CAUTION KOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Protease Inhibitors | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| ProteinA/G-MNase | Epicypher | 15-1016 | pA/G-MNase |
| ProteinA-MNase, purified from pK19pA-MN | Addgene | 86973 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q33230 | |
| Qubit Assay tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit Fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33238 | |
| Quick Ligase with 2X Quick Ligase buffer | New England Biolabs | M2200S | |
| RNase A | New England Biolabs | T3010 | |
| Sodium Acetate (NaOAc) | ThermoFisher Scientific | BP333-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S5150-1L | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | ThermoFisher Scientific | BP166-500 | SDS is poisonous if inhaled; handle with care in well ventilated spaces using gloves, eye protection, and an N95-grade respirator when handling |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-1 | NaOH is an eye/skin irritant as a solid and corrosive in solution. Handle in a chemical fume hood using gloves, a lab coat, and goggles |
| Spermidine | Sigma Aldrich | S2626 | |
| Standard Inverted Light Microscope | Leica | 11526213 | |
| Standard lab agarose gel materials | Varies | ||
| Standard lab materials such as serological pipettes and pipette tips | Varies | ||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| Tabletop vortexer | Fisher Scientific | 2215414 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | |
| Thermomixer | Eppendorf | 5384000020 | Alternatively, can use a waterbath |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | Triton X-100 is hazardous; use a lab coat, gloves, and goggles when handling |
| Trypsin | Fisher Scientific | MT25052 | |
| Tube rotator | VWR | 10136084 | |
| USER enzyme | New England Biolabs | M5505S |
Referências
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Irvine, R. A., Lin, I. G., Hsieh, C. -. L. DNA methylation has a local effect on transcription and histone acetylation. Molecular and Cellular Biology. 22 (19), 6689-6696 (2002).
- Albert, I., et al. Translational and rotational settings of H2A.Z nucleosomes across the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 446 (7135), 572-576 (2007).
- Blat, Y., Kleckner, N. Cohesins bind to preferential sites along yeast chromosome III, with differential regulation along arms versus the centric region. Cell. 98 (2), 249-259 (1999).
- Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nature Biotechnology. 33 (4), 395-401 (2015).
- O’Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Cao, Z., Chen, C., He, B., Tan, K., Lu, C. A microfluidic device for epigenomic profiling using 100 cells. Nature Methods. 12 (10), 959-962 (2015).
- Shankaranarayanan, P., et al. Single-tube linear DNA amplification (LinDA) for robust ChIP-seq. Nature Methods. 8 (7), 565-567 (2011).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Grosselin, K., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).
- Adli, M., Bernstein, B. E. Whole-genome chromatin profiling from limited numbers of cells using nano-ChIP-seq. Nature Protocols. 6 (10), 1656-1668 (2011).
- Zwart, W., et al. A carrier-assisted ChIP-seq method for estrogen receptor-chromatin interactions from breast cancer core needle biopsy samples. BMC Genomics. 14, 232 (2013).
- Valensisi, C., Liao, J. L., Andrus, C., Battle, S. L., Hawkins, R. D. cChIP-seq: a robust small-scale method for investigation of histone modifications. BMC Genomics. 16, 1083 (2015).
- Brind’Amour, J., et al. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nature Communications. 6, 6033 (2015).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. C. h. I. C. ChlC and ChEC; genomic mapping of chromatin proteins. Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nature Communications. 6, 8733 (2015).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, 21856 (2017).
- Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, 46314 (2019).
- Hainer, S. J., Bošković, A., McCannell, K. N., Rando, O. J., Fazzio, T. G. Profiling of pluripotency factors in single cells and early embryos. Cell. 177 (5), 1319-1329 (2019).
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).
- Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747 (2019).
- Gopalan, S., Wang, Y., Harper, N. W., Garber, M., Fazzio, T. G. Simultaneous profiling of multiple chromatin proteins in the same cells. Molecular Cell. 81 (22), 4736-4746 (2021).
- Patty, B. J., Hainer, S. J. Transcription factor chromatin profiling genome-wide using uliCUT&RUN in single cells and individual blastocysts. Nature Protocols. 16 (5), 2633-2666 (2021).
- Zheng, X. -. Y., Gehring, M. Low-input chromatin profiling in Arabidopsis endosperm using CUT&RUN. Plant Reproduction. 32 (1), 63-75 (2019).
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
