सरफेस प्लास्मोन रेजोनेंस के माध्यम से इंजीनियरिंग एंटीवायरल एजेंट
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एचए, एस ग्लाइकोप्रोटीन, संबंधित हाइब्रिड-टाइप ग्लाइकेन्स और उच्च-मैनोस ऑलिगोसैकराइड्स के लिए सीवी-एन बाइंडिंग की जांच करने के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख के लिए नए उपकरणों का वर्णन करता है। एसपीआर का उपयोग इन ग्लाइकेन्स के लिए डिमेरिक या मोनोमेरिक सीवी-एन को बांधने के लिएकेडी को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
Abstract
सरफेस प्लास्मोन रेजोनेंस (एसपीआर) का उपयोग हेमग्लूटिनिन (एचए) को डोमेन-स्वैप्ड साइनोविरिन-एन (सीवी-एन) डिमर से बांधने और मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स और सीवी-एन के उच्च-आत्मीयता बाइंडिंग साइट के बीच बातचीत की निगरानी करने के लिए किया जाता है। वायरस लिफाफा स्पाइक्स जीपी 120, एचए, और इबोला ग्लाइकोप्रोटीन (जीपी) 1,2 को डिमेरिक सीवीएन 2 पर उच्च और निम्न-आत्मीयता बाध्यकारी साइटों दोनों को बांधने के लिए रिपोर्ट किया गया है। डिमनोसिलेटेड एचए पेप्टाइड दो कम-आत्मीयता बाध्यकारी साइटों पर सीवीएन 2 के एक इंजीनियर अणु से भी बंधा हुआ है, जो संबंधित लिगैंड के लिए एक उच्च-आत्मीयता साइट को सहन कर रहा है और कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी जेब में एक स्थिर डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को बदलने के लिए उत्परिवर्तित होता है, इस प्रकार मल्टीवेलेंट बाइंडिंग की पुष्टि करता है। एचए बाइंडिंग को 275 एनएम के पृथक्करण स्थिरांक (केडी) पर छद्म-एंटीबॉडी सीवीएन 2 की एक उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी साइट पर दिखाया गया है जो ओलिगोमेराइजेशन के माध्यम से मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) को बेअसर करता है। डोमेन-स्वैप किए गए सीवीएन 2 में डाइसल्फ़ाइड पुलों की संख्या को सहसंबंधित करने से, जो ग्लूटामिक एसिड और आर्जिनिन के ध्रुवीय अवशेष जोड़े में सिस्टीन को प्रतिस्थापित करके 4 से 2 तक कम हो जाते हैं, के परिणामस्वरूप एचए के लिए बाध्यकारी संबंध कम हो जाता है। सबसे मजबूत इंटरैक्शन में से, इबोला जीपी 1,2 सीवीएन 2 से जुड़ा हुआ है, जिसमें ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के बिना लिफाफा ग्लाइकन का उपयोग करके निचले नैनोमोलर रेंज में दो उच्च-आत्मीयता बाध्यकारी साइटें हैं। वर्तमान अध्ययन में, मल्टीस्पेसिफिक मोनोमेरिक सीवी-एन को गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) स्पाइक (एस) ग्लाइकोप्रोटीन से जोड़ने को नैनोमोलर केडी की तुलना मेंकेडी = 18.6 μM पर मापा जाता है, और मध्य-μ-मोलर रेंज में इसके रिसेप्टर-बाइंडिंगडोमेन के माध्यम से मापा जाता है।
Introduction
टेथेरिन से जुड़ी एंटीवायरल गतिविधि इंटरफेरॉन-α द्वारा प्रेरित होती है, और इसमें प्रोटीन-आधारित टेथर शामिल होते हैं, जो संक्रमित कोशिका सतहों पर पूरी तरह से गठित वायरियन के प्रतिधारण की ओरजाता है। वायरस रिलीज के निषेध में टेथेरिन ग्लाइकोसिलेशन की आवश्यकता अनिश्चित बनी हुई है, जिसका अर्थ है कि इन विट्रो अध्ययन 1,2 के लिए पुनः संयोजक रूप से व्यक्त ग्लाइकेन्स पर ग्लाइकोसिलेशन पैटर्न का महत्व, जो (इन्फ्लूएंजा वायरस के मामले में) सतह-व्यक्त इन्फ्लूएंजा हेमग्लूटिनिन एचए 3,4 की रचना पर निर्भर करता है . यह नोट किया गया है कि एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन से जुड़े ओलिगोसैकराइड का संशोधन एचआईवी टाइप -1 रिलीज2 के टेथरिन-मध्यस्थता प्रतिबंध के लिए पर्याप्त है, जबकि डिमराइजेशन वायरस रिलीज को रोकने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है, जिससे ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन या ग्लाइकोसिल-फॉस्फेटिडिल-इनोसिटोल (जीपीआई) -एंकर शामिलहोते हैं। . कई लिफाफे वाले वायरस, रेट्रोवायरस और फिलोवायरस को अवरुद्ध करने के लिए मानव और मुराइन टेथेरिन के लिए अद्वितीय विशेषताओं का वर्णन किया गया है। बीएसटी -2 / टेथरिन जन्मजात प्रतिरक्षा 1,6 का एक इंटरफेरॉन-इंड्यूसेबल एंटीवायरल प्रोटीन है, जो व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीवायरल गतिविधि के साथ कार्य करता है और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन5 द्वारा या तो टेथेरिन को स्थानांतरित करने या टेथरिन6 की संरचना को बाधित करने के लिए विरोध किया जाता है। उदाहरण के लिए, इन्फ्लूएंजा ए वायरस पर सतह-व्यक्त लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन एचए और न्यूरामिनिडेस एक तनाव-विशिष्ट तरीके से टेथेरिन प्रतिरोध के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है, जिससे मेजबान रिसेप्टर बाइंडिंग साइटों की पहचान की सुविधा मिलतीहै। ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी का अध्ययन एचए पर तेजी से अनुकूलित ग्लाइकन ढाल के साथ उनकी बातचीत के स्टोइकोमेट्री में किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप इन्फ्लूएंजा ए एच 3 एन 2 और एच 1 एन 1 उपप्रकार4 के लिए बाध्यकारी संबंध होता है।
एंटीवायरल एजेंटों और वायरस लिफाफा स्पाइक्स, यानी, कार्बोहाइड्रेट लिगेंड, और पूरक इम्यूनोलॉजिकल और स्पेक्ट्रोस्कोपिक तरीकों के बीच बाध्यकारी तंत्र को स्पष्ट करने के लिए, मोनो-, डी- और ट्राई-मैनोस मोइटीज को रासायनिक रूप से संश्लेषित किया जाता है। मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स ग्लाइकोसिल {बीटा}-पेरासिटेट्स के एज़िडो ग्लाइकोसिलेशन के माध्यम से 1,2-ट्रांस ग्लाइकोसिल एज़ाइड्स ट्रांसफॉर्मेशन9 के माध्यम से बनाए जाते हैं, जो आमतौर पर पाए जाने वाले एन-एसिटाइल ग्लूकोसामाइन और जीवन-धमकाने वाले वायरस की सतह पर उच्च-मैनोज़ ओलिगोसेकेराइड की नकल करते हैं। ट्रायज़ोल बायोआइसोस्टर का उपयोग उन लिंकेज की नकल करने के लिए किया जाता है जो एचए पेप्टाइड10 के मैनोसिलेटेड अवशेष बनाते हैं और एचए हेड डोमेन पर दूसरे एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन स्पॉट के आसपास एंटीवायरल सीवी-एन डेरिवेटिव के साथ साइट-विशिष्ट इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करते हैं (4 एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स एन 54, एन 97, एन 181, एन 301 के साथ एचए टॉप)8,11,12 . ग्लूटामिक एसिड (ग्लू) और आर्जिनिन (एआरजी) और परिणामस्वरूप हेलिक्स द्विध्रुवीय के बीच बातचीत ने मॉडल पेप्टाइड्स और प्रोटीन दोनों की अच्छी स्थिरता प्रकट की, लेकिन एसपीआर का उपयोग करके कल्पना की जाती है। यदि ग्लाइकन मोइटीज़ पर रिसेप्टर बाइंडिंग को सीधे बाधित करके एचए10 पर एकल रासायनिक रूप से संश्लेषित ग्लाइकोसिलेशन साइट को पहचानने के साथ तुलना की जाती है, तो इसके रिसेप्टर के लिए चार-साइट उत्परिवर्तित एफसी संरचना का एक उच्च संबंध विवो में प्रभावकारक कार्यों को प्राप्त करने के लिए दिखाया जाता है,जो एफसी उत्परिवर्ती से जुड़े एन-लिंक्ड ग्लाइकेन्स की असंबंधित संरचना को यांत्रिक रूप से निर्धारित करने के लिए प्रकट करता है।
सीवी-एन एचआईवी 14,15, इन्फ्लूएंजा 16 और इबोला वायरस के खिलाफ एंटीवायरल गतिविधि प्रदर्शित करता है, जो लिफाफा स्पाइक प्रोटीन12,17,18,19 पर उच्च-मैनोस ऑलिगोसेकेराइड संशोधनों के लिए नैनोमोलर बाइंडिंग द्वारा मध्यस्थता करता है। सीवी-एन में एक उच्च-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग साइट (एच) या सहसंयोजक रूप से जुड़े डिमेरिक सीवीएन 2 में दो एचएस के लिए इन्फ्लुएंजा एचए बाइंडिंग को क्रमशः संतुलन पृथक्करण स्थिरांक (केडी) = 5.7 एनएम (चित्रा 1 ए) और केडी = 2.7 एनएम निर्धारित किया जाता है। सीवी-एन और सीवीएन 2 दोनों एक या दो कम-आत्मीयता कार्बोहाइड्रेट-बाध्यकारी साइटों (एल) के 12,17,20,21 को आश्रय देते हैं। इबोला जीपी 1,2 कम नैनोमोलर रेंज (केडी = 26 एनएम) में समानताओं के साथ सीवीएन 2 के 2 एच को बांधता है। सीवी-एन डब्ल्यूटी इबोला जीपी 1,2 और एचए के लिए बाध्यकारी केडी = 34 एनएम से केडी = 5.7 एनएम (ए / न्यूयॉर्क / 55/04)12 से समानताएं प्रदर्शित करता है। सीवी-एन जैसे लेक्टिन, जो विशेष रूप से वायरल लिफाफे पर उच्च-मैनोज़ ग्लाइकेन्स को लक्षित करते हैं, हेपेटाइटिस सी वायरस, सार्स-सीओवी, हर्पीसवायरस, मारबर्ग वायरस और खसरा वायरस22 की प्रतिकृति को रोकते हैं।
छोटे सीवी-एन अणु का 20 से अधिक वर्षों तक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है क्योंकि यह वायरल प्रविष्टि16,18 को रोकने के लिए वायरस की एक विस्तृत श्रृंखला को बांधने के लिए कार्यात्मक है। संरचनात्मक विश्लेषण और बाध्यकारी आत्मीयता परख वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन10,19 के लिए उत्साह बढ़ाने के लिए माइक्रोमोलर रेंज में द्विसंयोजक बंधन द्वारा एक डोमेन-स्वैप किए गए सीवीएन 2 डिमर में दो एल की क्रॉस-लिंकिंग का संकेत देते हैं। मैन (8) डी 1 डी 3 हथियारों और मैन (9) पर मैन1-2मैन के चयनात्मक बंधन में विपरीत प्रोटीन प्रोटोमर्स20 पर स्थित अलग-अलग समानताओं के दो बाध्यकारी स्थल शामिल हैं, जिससे नैनोमोलर बाइंडिंग समानताओं तक पहुंचते हैं (चित्रा 1 बी)। इस प्रकार, सीवीएन 2 को एचआईवी जीपी 120 पर एपिटोप्स को बांधने के लिए इसके आवेदन से संबंधित एक छद्म एंटीबॉडी माना जाता है, जो वायरस-न्यूट्रलाइजिंग एंटीबॉडी17 के समान है। इसमें, लेखक अपने रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी) के माध्यम से सार्स-सीओवी-2 स्पाइक के लिए सीवीएन 2 के संभावित बंधन की जांच करने में रुचि रखता है। सार्स-सीओवी-2 आरबीडी के साथ स्थिर मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम (एसीई)-2 के बाध्यकारी वक्रों के परिणामस्वरूप इस जैविक रूप से प्रासंगिक बाध्यकारी इंटरैक्शन के लिएकेडी = 4.7 एनएम होताहै।
इसके विपरीत, चयनित इम्युनोग्लोबुलिन वर्ग विशिष्ट और सुसंगत संरचनात्मक प्रोटीन पैटर्न को पहचानते हैं, जो झिल्ली-लंगर वाले एचए क्षेत्रों में आत्मीयता परिपक्वता के लिए एक सब्सट्रेट प्रदान करतेहैं। सीवी-एन लगभग सभी इन्फ्लूएंजा ए और बी वायरस16 में अत्यधिक शक्तिशाली गतिविधि दिखाता है, और यह व्यापक रूप से निष्क्रिय एंटीवायरल एजेंट है। हमारा ज्ञान एचए 1 और एचए 2 के तने पर लक्षित एपिटोप्स के स्थान पर अधूरा है जिसमें संभवतः एंटीबॉडी को अत्यधिक निष्क्रिय करके और लेक्टिन बाइंडिंग25 की तुलना में ग्लाइकन-लक्ष्यीकरण के लिए एपिटोपिक संरचनाएं शामिल हैं।
चित्रा 1: सीवी-एन के लिए एसपीआर बाइंडिंग परख का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व वायरस लिफाफा स्पाइक्स। (ए) सीवी-एन बाइंडिंग के लिए एसपीआर परख लिगैंड से: एचए पूर्ण लंबाई प्रोटीन (90 केडीए)। काइनेटिक डेटा सेट (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2.5, 0 एनएम) इन्फ्लूएंजा एचए ए / न्यूयॉर्क / 55/04 (एच 3 एन 2) के लिए वास्तविक समय डबल-संदर्भित बाइंडिंग दिखाता है। (बी) सीवीएन 2 एल 0 संस्करण वी 2 500 एनएम से 16 एसएम की एकाग्रता सीमा के भीतर स्थिर लिगैंड डीएम से जुड़ा हुआ है। एच अवशेषों को ग्रे रंग में हाइलाइट किया गया है। E58 और R73 वाइल्डटाइप प्रोटीन में सिस्टीन के लिए एक प्रतिस्थापन हैं और V2 को चार डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के बजाय तीन के साथ एक स्थिर प्रोटीन फोल्ड बनाते हैं कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जबकि झिल्ली-डिस्टल एचए शीर्ष भाग पर ग्लाइकन ढाल सीवी-एन12 के लिए उच्च-आत्मीयता बंधन को प्रेरित करता है, एचए शीर्ष भाग के डाइसल्फ़ाइड पुल से सटे एचए के लिए सीवीएन 2 बाइंडिंग को इसके कम-आत्मीयता साइटों10,12 पर देखा गया है। सीवी-एन द्वारा कार्बोहाइड्रेट-बाइंडिंग में विभिन्न ध्रुवीय इंटरैक्शन और इंटरैक्शन साइटों की पहचान की जाती है। इन इंटरैक्शन को बाइंडिंग साइट में नॉक-आउट वेरिएंट उत्पन्न करके सत्यापित किया जाता है ताकि सिलिको अनुमानित ग्लाइकोसिलेशन12 में बाइंडिंग समानताओं को सहसंबंधित किया जा सके। इस प्रकार, परियोजना का उद्देश्य सार्स-संबंधित 2019-एनसीओवी स्पाइक्स और सार्स-सीओवी-2 से लघु पेप्टाइड अनुक्रमों के साथ बंधन संबंध और विशिष्टता में पहले से परीक्षण किए गए रासायनिक रूप से मैनोसिलेटेड एचए पेप्टाइड्स की तुलना करना है, जो स्वाभाविक रूप से विभिन्न एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन साइटों और ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन की एक छोटी संख्या द्वारा संशोधित होते हैं। क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और बाइंडिंग परख का उपयोग करते हुए, पिंटो और सहकर्मियों ने एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, एस 309 की रिपोर्ट की, जो संभावित रूप से रिसेप्टर अटैचमेंट26 के साथ प्रतिस्पर्धा किए बिना सार्स-सीओवी-2 स्पाइक प्रोटीन पर एक एपिटोप को पहचानता है, जिसमें सर्बेकोवायरस उपजीनस के भीतर एक संरक्षित ग्लाइकन होता है। इस अध्ययन का प्रोटोकॉल बताता है कि सीवी-एन वेरिएंट को डिजाइन करना, व्यक्त करना और विशेषता देना यह अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सीवी-एन और सीवीएन 2 एसपीआर तकनीक10,12 का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन और सिंथेटिक मैनोसिलेटेड पेप्टाइड्स से कैसे जुड़ते हैं।
टेंडम-लिंक्ड डिमर सीवीएन 2 एल 027 और बाइंडिंग-साइट वेरिएंट (वी 2-वी 5) को पुनः संयोजक रूप से व्यक्त किया जाता है और वेरिएंट डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड रिप्लेसमेंट (सी 58 ई और सी 73 आर) के साथ होते हैं (चित्रा 2 ए)। इसके अलावा, एकल-बिंदु उत्परिवर्तन ई 41 ए के साथ एक उत्परिवर्ती तैयार किया जाता है क्योंकि इस स्थिति को एक इंटरमॉलिक्युलर क्रॉस-कॉन्टैक्टिंग अवशेष के रूप में देखा गया है। यह उत्परिवर्ती लेक्टिन और उच्च-मैनोज़ ओलिगोसेकेराइड्स के बीच एसपीआर बाइंडिंग माप के लिए एक और दिलचस्प अणु है जो बाइंडिंग डोमेन को समझता है और डिमेरिक फॉर्म के साथ तुलना की अनुमति देता है। सीवीएन 2 की डोमेन-स्वैप क्रिस्टल संरचना एक लचीला लिंकर दिखाती है, जो 49 और 54 अवशेषों के बीच फैली हुई है। दो डोमेन कठोर निकायों के रूप में हिंज के चारों ओर घूमना जारी रख सकते हैं, या तो इंट्रामोलेक्यूलर डोमेन इंटरैक्शन (डोमेन ए-अवशेष 1-39; 90-101- डोमेन बी-अवशेष 40-89 के साथ) के माध्यम से एक मोनोमर विकसित कर सकते हैं या इंटरमॉलिक्युलर डोमेन स्वैपिंग द्वारा एक डिमर [डोमेन ए (पहले मोनोमर का) डोमेन बी (दूसरे का), और डोमेन बी (पहली मोनोमर का) डोमेन ए (दूसरी प्रति का)] के साथ। ग्लू 4128 को छोड़कर, दो प्रोटोमर्स ए और बी डोमेन के बीच कोई करीबी बातचीत नहीं है। सीवी-एन के लिए जीन को 40-मेर संश्लेषित ऑलिगोस29 के साथ दोहराव वाली पीसीआर विधि का उपयोग करके विकसित किया जा सकता है और फिर इसे पीईटी 11 ए के एनडीईआई और बीएएमएचआई साइटों में विभाजित किया जाता है ताकि इलेक्ट्रोकॉम्पिटेंट कोशिकाओं में परिवर्तन (इलेक्ट्रोपोरेशन) किया जा सके, जैसा कि कीफ, जे.आर.27 द्वारा वर्णित है। प्रोटीन, जिसका उपयोग संबंधित क्रिस्टल संरचना (पीडीबी आईडी 3 एस 3 वाई) को प्राप्त करने के लिए किया जाता है, में एक एन-टर्मिनल 6-हिस्टिडाइन शुद्धिकरण टैग शामिल है, जिसके बाद फैक्टर एक्सए प्रोटीज क्लीवेज साइट है। साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग बिंदु उत्परिवर्तन करने, कोडन स्विच करने और अमीनो एसिड विनिमय के लिए एकल या एकाधिक बेस या कोडन डालने या हटाने के लिए किया जाता है। ये परिवर्तन प्रोटीन फ़ंक्शन और संरचना में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। पुनः संयोजक रूप से व्यक्त और शुद्ध सीवी-एन, सीवीएन 2, और सीवीएन 3 का जैव-भौतिक रूप से अच्छी तरह से अध्ययन किया गया है 20,21,27, उत्पादन करने के लिए सस्ते हैं, और इसलिए एसपीआर सेंसर चिप्स पर स्थिर ग्लाइकेन के लिए बाध्यकारी परख को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है। पारंपरिक एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) ग्लाइकन लिगेंड के स्थिरीकरण तकनीक से संबंधित कम प्रजनन क्षमता प्रदान करता है और विभिन्न बाइंडिंग-साइट वेरिएंट के वास्तविक समय बाइंडिंग को बदल देता है, जो एसपीआर के लिए दिखाया गया है, समापन बिंदु परख में।
बाइंडिंग-एफिनिटी वेरिएंट CVN2L0-V2 (डाइसल्फ़ाइड ब्रिज प्रतिस्थापन10 के साथ होमोडिमेरिक सीवी-एन की एक बरकरार तह) को एस्चेरिचिया कोलाई (ई. कोलाई) में हिस-टैग के साथ व्यक्त किया जाता है, जिसे आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके नी-एनटीए कॉलम पर शुद्ध किया जाता है और एसपीआर का उपयोग करके एचए (एच 3 एन 2), मोनोमैनोसिलेटेड एचए-पेप्टाइड और डायमैनोसिलेटेड एचए-पेप्टाइड से जुड़ने के लिए परीक्षण किया जाता है। प्रतिक्रियाशील एस्टर या बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रोटीन इंजीनियरिंग के माध्यम से। अनुक्रमिक रन की एक ही प्रक्रिया उन लिगेंड पर लागू होती है, जो30 के नीचे वर्णित आणविक इंटरैक्शन विश्लेषण के लिए गतिज जानकारी प्राप्त करने के लिए सीवी-एन और सीवी-एन (और सीवीएन 2) के विभिन्न कमजोर पड़ने को इंजेक्ट करती है। आरबीडी-स्थिर एसपीआर सेंसर चिप का उपयोग सीवी-एन से एस पेप्टाइड्स पर बाध्यकारी अध्ययन के लिए किया जाता है, और समानताओं की तुलना मानव एसीई 2 के साथ सार्स-सीओवी -2 बाइंडिंग से की जाती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीवी-एन की बाध्यकारी आत्मीयता कार्यात्मक बाइंडिंग साइटों की संख्या के साथ सहसंबद्ध है [डोमेन बी पर 2 एच, और डोमेन (एस) ए पर 2 एल जब डोमेन-स्वैप्ड डिमर के रूप में इंजीनियर किया जाता है]। परिवर्तित बाइंडिंग ए…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ने टीयू वीन में जैव प्रौद्योगिकी और माइक्रोबायोलॉजी विभाग और चिकित्सा विभाग III, वियना मेडिकल यूनिवर्सिटी में नेफ्रोलॉजी और डायलिसिस विभाग से डॉ क्रिश्चियन डर्नटल को स्वीकार किया, विशेष रूप से तकनीकी और वैज्ञानिक सहायता के लिए डॉ मार्कस वाहरमैन। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्राकृतिक संसाधन और जीवन विज्ञान विश्वविद्यालय (बीओकेयू) वियना में जैव प्रौद्योगिकी विभाग द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक एसपीआर बाध्यकारी परख करने पर सहायक वैज्ञानिक चर्चाओं के लिए जर्मनी के ड्यूसेलडोर्फ में ज़ैनटेक बायोएनालिटिक्स के डॉ निको डैंकबार को अपनी गहरी स्वीकृति व्यक्त करना चाहता है।
Materials
| Äkta primeplus | Cytiva | ||
| Amicon tubes | Merck | C7715 | |
| Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
| Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
| Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
| Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
| Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
| Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
| Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
| DTT | Merck | DTT-RO | |
| EDC | Merck | 39391 | |
| EDTA | Merck | E9884 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
| Ethanol | Merck | 51976 | |
| Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
| Glucose | Merck | G8270 | |
| Glycine HCl | Merck | 55097 | |
| HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
| HEPES | Merck | H3375 | |
| His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
| Imidazole | Merck | I2399 | |
| IPTG | Merck | I6758 | |
| Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
| LB agar | Merck | 52062 | |
| LB agar | Merck | 19344 | |
| LB Lennox | Merck | L3022 | |
| Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
| Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
| Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
| NaH2P04 | Merck | S0751 | |
| NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| NaOH | Merck | S5881 | |
| NHS | Merck | 130672 | |
| NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
| PBS | Merck | 806552 | |
| PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
| Peptone | Merck | 70171 | |
| pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
| PMSF | Merck | PMSF-RO | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
| Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
| Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
| Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
| SDS | Merck | 11667289001 | |
| Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
| Sodim chloride | Merck | S9888 | |
| Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
| SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
| SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
| Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
| TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
| Triton-X100 | Merck | T8787 | |
| Tryptone | Merck | 93657 | |
| Tween20 | Merck | P1379 | |
| Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
| X-gal | Merck | XGAL-RO | |
| XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
| Yeast extract | Merck | Y1625 |
References
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