Detta protokoll beskriver nya verktyg för SPR-bindningsanalyser för att undersöka CV-N-bindning till HA, S-glykoprotein, relaterade glykaner av hybridtyp och högmannosoligosackarider. SPR används för att bestämma KD för att binda antingen dimerisk eller monomer CV-N till dessa glykaner.
Ytplasmonresonans (SPR) används för att mäta hemagglutinin (HA) bindning till domänbytta Cyanovirin-N (CV-N) dimer och för att övervaka interaktioner mellan mannosylerade peptider och CV-N: s bindningsställe med hög affinitet. Virushöljespikar gp120, HA och Ebolaglykoprotein (GP) 1,2 har rapporterats binda både hög- och lågaffinitetsbindningsställen på dimerisk CVN2. Dimannosylerad HA-peptid är också bunden vid de två bindningsställena med låg affinitet till en konstruerad molekyl av CVN2, som bär ett högaffinitetsställe för respektive ligand och muteras för att ersätta en stabiliserande disulfidbindning i kolhydratbindningsfickan, vilket bekräftar multivalent bindning. HA-bindning visas till ett bindningsställe med hög affinitet för pseudo-antikropp CVN2 vid en dissociationskonstant (KD) på 275 nM som ytterligare neutraliserar humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) genom oligomerisering. Korrelering av antalet disulfidbroar i domänbytta CVN2, som minskas från 4 till 2 genom att ersätta cystiner i polära restpar av glutaminsyra och arginin, resulterar i minskad bindningsaffinitet till HA. Bland de starkaste interaktionerna är Ebola GP1,2 bunden av CVN2 med två bindningsställen med hög affinitet i det lägre nanomolära intervallet med hjälp av kuvertglykanen utan en transmembrandomän. I den aktuella studien mäts bindningen av det multispecifika monomera CV-N till svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spik (S) glykoprotein vid K D = 18,6 μM jämfört med nanomolar KD till de andra virusspikarna och via dess receptorbindande domän i mitten av μ-molarområdet.
Tetherinassocierad antiviral aktivitet induceras av interferon-α, och den består av proteinbaserade tjuder, vilket leder till retention av fullbildade virioner på infekterade cellytor1. Nödvändigheten av tetheringlykosylering vid hämning av virusfrisättning är fortfarande osäker, vilket innebär betydelsen av glykosyleringsmönster på rekombinant uttryckta glykaner för in vitro-studier 1,2, vilket beror på konformationen av (i fallet med influensavirus) ytuttryckt influensahemagglutinin HA 3,4 . Det har noterats att modifiering av oligosackarid bunden till N-länkad glykosylering är tillräcklig för tetherinmedierad begränsning av HIV-typ-1-frisättning2, medan dimerisering spelar en viktig roll för att förhindra virusfrisättning, vilket involverar transmembrandomänen eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -ankare för att binda de spirande virionerna5 . Unika egenskaper beskrivs för mänsklig och murin tetherin för att blockera flera höljeförsedda virus, retrovirus och filovirus. BST-2/tetherin är ett interferoninducerbart antiviralt protein med den medfödda immuniteten1,6, som verkar med bredspektrum antiviral aktivitet och motarbetas av kuvertglykoproteiner5 för att antingen translokera tetherin eller störa strukturen hos tetherin 6. Till exempel är ytuttryckt kuvertglykoprotein-HA och neuraminidas på influensa A-virus välkända för tetherinantagonism på ett stamspecifikt sätt7, vilket underlättar igenkänningen av värdreceptorbindningsställen8. Glykaninriktade antikroppar studeras i stökiometrin av deras interaktioner med de snabbt anpassade glykansköldarna på HA, vilket resulterar i bindningsaffinitet till influensa A H3N2 och H1N1 subtyper4.
För att belysa bindningsmekanismerna mellan antivirala medel och virushöljespikar, dvs kolhydratligander och komplementära immunologiska och spektroskopiska metoder, syntetiseras mono-, di- och tri-mannosdelar kemiskt. De mannosylerade peptiderna skapas via azidoglykosylering av glykosyl {beta}-peracetater till 1,2-transglykosylazider transformation9, vilket efterliknar de typiskt funna N-acetylglukosamin- och högmannosoligosackariderna på ytan av livshotande virus. Triazolbioisosterer används för att efterlikna kopplingar som bildar den mannosylerade återstoden av HA-peptid10 och underlätta platsspecifika interaktioner med antivirala CV-N-derivat runt den andra N-länkade glykosyleringsplatsen på HA-huvuddomänen (HA-topp med 4 N-länkade glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellan glutaminsyra (Glu) och arginin (Arg) och den resulterande spiraldipolen manifesterade god stabilitet hos både modellpeptider och proteiner men visualiseras med hjälp av SPR. Om man jämför med att känna igen ett enda kemiskt syntetiserat glykosyleringsställe på HA10 genom att direkt hämma receptorbindningen på glykandelarna, visas en högre affinitet hos en muterad Fc-struktur med fyra platser till dess receptor för att framkalla effektorfunktioner in vivo, vilket avslöjar den orelaterade sammansättningen av N-länkade glykaner bundna till Fc-mutant som ska bestämmas mekanistiskt13.
CV-N visar antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa16 och ebolavirus, som förmedlas av nanomolär bindning till oligosackaridmodifieringar med hög mannos på kuvertspikproteiner12,17,18,19. Influensa-HA-bindning till ett kolhydratbindningsställe med hög affinitet (H) i CV-N eller två Hs i kovalent bunden dimerisk CVN2 bestäms ha jämviktsdissociationskonstanter (K D) = 5,7 nM (figur 1A) respektive KD = 2,7 nM. Både CV-N och CVN2 har ytterligare ett eller två kolhydratbindande ställen med låg affinitet (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder till 2H av CVN2 med affiniteter i det lägre nanomolära området (KD = 26 nM). CV-N WT-bindning till Ebola GP1,2 och HA uppvisar affiniteter från K D = 34 nM till KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt riktar sig mot glykaner med hög mannos på virushöljena, hämmar ytterligare replikation av hepatit C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus och mässlingvirus22.
Den lilla CV-N-molekylen har studerats noggrant i mer än 20 år eftersom den fungerar för att binda ett brett spektrum av virus för att hämma viral inträde16,18. Strukturella analyser och bindningsaffinitetsanalyser indikerar tvärbindning av två Ls i en domänbytad CVN2-dimer genom bivalent bindning i det mikromolära intervallet för att förbättra aviditeten till virala kuvertglykoproteiner10,19. Selektiv bindning av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armar och Man(9) består av två bindningsställen med olika affiniteter belägna på motsatta proteinprotomerer20 och når därmed nanomolära bindningsaffiniteter (figur 1B). Således anses CVN2 vara en pseudoantikropp angående dess tillämpning för att binda epitoper på HIV gp120, liknande virusneutraliserande antikroppar17. Häri är författaren intresserad av att undersöka den potentiella bindningen av CVN2 till SARS-CoV-2-spiken via dess receptorbindande domän (RBD). Bindningskurvor för immobiliserat humant angiotensinkonverterande enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterar i KD = 4,7 nM för denna biologiskt relevanta bindningsinteraktion23.
Däremot känner utvalda immunglobulinklasser igen specifika och konsekventa strukturella proteinmönster, vilket ger ett substrat för affinitetsmognad i de membranförankrade HA-regionerna24. CV-N visar mycket potent aktivitet i nästan alla influensa A- och B-virus16, och det är ett i stort sett neutraliserande antiviralt medel. Vår kunskap är ofullständig om placeringen av riktade epitoper på stammen av HA1 och HA2 som möjligen involverar epitopiska strukturer för glykaninriktning genom starkt neutraliserande antikroppar och jämfört med lektinbindande25.
Figur 1: Schematisk representation av SPR-bindningsanalysen för CV-N till virushöljespikar. (A) SPR-analys för CV-N-bindning till ligand: HA fullängdsprotein (90 kDa). Kinetisk datamängd (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) som visar dubbelrefererad bindning i realtid till influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 bindning till immobiliserad ligand DM inom ett koncentrationsområde på 500 nM till 16 μM. Sekvens: L-rester markeras med gult. H-rester markeras i grått. E58 och R73 är en ersättning för cysteiner i vildtypsproteinet och gör V2 till en stabil proteinveck med tre istället för fyra disulfidbindningar Klicka här för att se en större version av denna figur.
Medan glykanskölden på den membrandistala HA-övre delen inducerar högaffinitetsbindning till CV-N 12, har CVN2-bindning till HA intill en disulfidbro i HA-toppdelen ytterligare observerats vid dess lågaffinitetsställen10,12. Olika polära interaktioner och interaktionsställen identifieras i kolhydratbindning med CV-N. Dessa interaktioner verifieras genom att generera knock-out-varianter i bindningsstället för att korrelera bindningsaffiniteter till in silico-förutsagd glykosylering12. Således syftar projektet till att jämföra tidigare testade kemiskt mannosylerade HA-peptider i bindande affinitet och specificitet med korta peptidsekvenser från SARS-relaterade 2019-nCoV-spikar och SARS-CoV-2, naturligt förekommande modifierade av ett litet antal olika N-länkade glykosyleringsställen och O-länkad glykosylering. Med hjälp av kryoelektronmikroskopi och bindningsanalyser rapporterar Pinto och kollegor en monoklonal antikropp, S309, som potentiellt känner igen en epitop på SARS-CoV-2-spikprotein som innehåller en konserverad glykan inom Sarbecovirus-undersläktet, utan att konkurrera med receptorbindning26. Protokollet för denna studie beskriver hur design, uttryck och karakterisering av CV-N-varianter är viktiga för att studera hur CV-N och CVN2 binder till glykosylerade proteiner och syntetiska mannosylerade peptider med hjälp av SPR-tekniken10,12.
Tandembunden dimer CVN2L027 och bindningsplatsvarianter (V2-V5) uttrycks rekombinant och varianter är med disulfidbindningsersättningar (C58E och C73R) (Figur 2A). Dessutom framställs en mutant med en enpunktsmutation E41A eftersom denna position har setts som en intermolekylär korskontaktrest. Denna mutant är en annan intressant molekyl för SPR-bindande mätningar mellan lektin- och högmannosoligosackarider som dechiffrerar bindningsdomäner och möjliggör jämförelse med den dimeriska formen. Den domänbytta kristallstrukturen för CVN2 visar en flexibel länkare som sträcker sig mellan 49 och 54 rester. De två domänerna kan fortsätta att röra sig runt gångjärnet som styva kroppar och utveckla antingen en monomer genom intramolekylära domäninteraktioner (domän A-rester 1-39;90-101- med domän B -rester 40-89) eller en dimer genom intermolekylär domänbyte [domän A (av den första monomeren) med domän B (av den andra) och domän B (av den första monomeren) med domän A (av den andra kopian)]. Det finns inga nära interaktioner mellan de två protomerernas A- och B-domäner, förutom Glu4128. Genen för CV-N kan utvecklas med hjälp av en repetitiv PCR-metod med 40-mer syntetiserade oligos29 och subkloneras sedan till NdeI- och BamHI-platserna för pET11a för transformation (elektroporering) till elektrokompetenta celler som beskrivs av Keeffe, J.R.27. Proteinet, som används för att uppnå respektive kristallstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderar en N-terminal 6-histidinreningstagg följt av en faktor Xa-proteasklyvningsplats. Platsstyrd mutagenes används för att göra punktmutationer, byta kodoner och infoga eller ta bort enstaka eller flera baser eller kodoner för aminosyrautbyte. Dessa transformationer ger ovärderlig insikt i proteinets funktion och struktur. Rekombinant uttryckt och renat CV-N, CVN2 och CVN3 har studerats biofysiskt väl 20,21,27, är billiga att producera och används därför för att karakterisera bindningsanalyser till glykaner immobiliserade på SPR-sensorchips. Konventionell enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) ger mindre reproducerbarhet avseende immobiliseringstekniken för glykanligander och omvandlar realtidsbindning av olika bindningsplatsvarianter, vilket visas för SPR, till slutpunktsanalyser.
Bindningsaffinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt vik av homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) uttrycks med en His-tagg i Escherichia coli (E. coli), renad över Ni-NTA-kolonn med affinitetskromatografi och testad för bindning till HA (H3N2), monomannosylerad HA-peptid och dimannosylerad HA-peptid med SPR. Kemiskt mannosylerade peptider, eller HA- och S-protein, är alla ligander och amin kopplade till den hydrofila chipytan via reaktiva estrar eller biotin-streptavidin proteinteknik. Samma procedur för sekventiella körningar tillämpas på dessa ligander, injicering av olika utspädningar av CV-N och varianter av CV-N (och CVN2) för att erhålla kinetisk information för molekylära interaktionsanalyser som beskrivs nedan30. RBD-immobiliserat SPR-sensorchip används för att binda studier på CV-N till S-peptider, och affiniteter jämförs med SARS-CoV-2-bindning med humant ACE2.
CV-N:s bindningstillhörighet korreleras med antalet funktionella bindningsställen [2H på domänerna B och 2L på domän(er) A när de konstrueras som domänbytta dimer]. En variant med en förändrad bindningsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil vik av CV-N bestående av en disulfidbro knock-out) uttrycks i E. coli, renas och testas positivt för bindning till HA-protein (H3N2) med SPR10, och visar en konformationsförändring vid bindning av HA med antingen H- eller L-kolhydra…
The authors have nothing to disclose.
Författaren erkänner Dr. Christian Derntl från Institutionen för bioteknik och mikrobiologi vid TU Wien och Institutionen för medicin III, Avdelningen för nefrologi och dialys vid Medicinska universitetet i Wien, särskilt Dr. Markus Wahrmann för tekniskt och vetenskapligt stöd. Proteinuttryck i däggdjursceller stöddes av institutionen för bioteknik vid University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Författaren vill uttrycka sitt djupa erkännande till Dr. Nico Dankbar från XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, för hjälpsamma vetenskapliga diskussioner om att utföra SPR-bindande analyser.
Äkta primeplus | Cytiva | ||
Amicon tubes | Merck | C7715 | |
Ampillicin | Sigma-Aldrich | A5354 | |
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge | Beckman Coulter | B06320 | |
Cell spreader | Sigma-Aldrich | HS86655 | silver stainless steel, bar L 33 mm |
Custom DNA Oligos | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
Custom Gensynthesis | GenScript | #1390661 | cloning vector: pET27b(+) |
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL | Thermo Scientific | 50-105-5354 | |
Dionex UlitMate 3000 | Thermo Scientific | IQLAAAGABHFAPBMBFB | |
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL) | Fisher Scientific | ER1701 | |
DTT | Merck | DTT-RO | |
EDC | Merck | 39391 | |
EDTA | Merck | E9884 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120086 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 30120094 | |
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge | Sigma-Aldrich | Z606235 | |
Ethanol | Merck | 51976 | |
Ethanolamine HCl | Merck | E6133 | |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack | Corning | 352057 | |
Glucose | Merck | G8270 | |
Glycine HCl | Merck | 55097 | |
HA H3 protein | Abcam | ab69751 | |
HEPES | Merck | H3375 | |
His-select Ni2+ | Merck | H0537 | |
Imidazole | Merck | I2399 | |
IPTG | Merck | I6758 | |
Kanamycin A | Sigma-Aldrich | K1377 | |
Kromasil 300-5-C4 | Nouryon | ||
LB agar | Merck | 52062 | |
LB agar | Merck | 19344 | |
LB Lennox | Merck | L3022 | |
Lysozyme | Merck | 10837059001 | |
Magnesium chloride | Merck | M8266 | |
Magnesium sulfate | Merck | M7506 | |
NaH2P04 | Merck | S0751 | |
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | |
NaOH | Merck | S5881 | |
NHS | Merck | 130672 | |
NZ amine (casein hydrolysate) | Merck | C0626 | |
PBS | Merck | 806552 | |
PD MidiTrap G-10 | Sigma-Aldrich | GE28-9180-11 | |
Peptone | Merck | 70171 | |
pET11a | Merck Millipore (Novagen) | 69436 | |
PMSF | Merck | PMSF-RO | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) | Qiagen | 27106X4 | |
Reichert Software Package Autolink1-1-9 | Reichert | ||
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System | Reichert | ||
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis | Reichert | ||
SDS | Merck | 11667289001 | |
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid | Stratagene | #200518 | |
Sodim chloride | Merck | S9888 | |
Sodium acetate.Trihydrate | Merck | 236500 | |
SPR sensor chip C19RBDHC30M | XanTec bioanalytics | SCR C19RBDHC30M | |
SPR sensor chip CMD500D | XanTec bioanalytics | SCR CMD500D | |
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes | Thermo Scientific | 101R20 | |
TBS | Merck | T5912 | 10x, solution |
Triton-X100 | Merck | T8787 | |
Tryptone | Merck | 93657 | |
Tween20 | Merck | P1379 | |
Vortex-Genie 2 Mixer | Merck | Z258423 | |
X-gal | Merck | XGAL-RO | |
XL1-Blue Supercompetent Cells | Stratagene | #200236 | |
Yeast extract | Merck | Y1625 |