ラマン色素による高多重化組織イメージング
Summary
虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングは、高度に多重化されたエピトープベースのタンパク質イメージングのための新しいプラットフォームです。ここでは、抗体調製、組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、およびepr-SRS組織イメージングを含む実用的なガイドを紹介します。
Abstract
組織内の膨大な範囲の特定のバイオマーカーを視覚化することは、複雑な生物学的システムの複雑な組織を探索する上で重要な役割を果たします。したがって、高度に多重化されたイメージング技術はますます高く評価されています。ここでは、虹のようなラマン色素の電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr-SRS)イメージングによる標準的な免疫蛍光に匹敵する感度を持つ特定のタンパク質の高度に多重化された振動イメージングの新たなプラットフォームについて説明します。この方法は、従来の免疫蛍光におけるスペクトル的に解決可能なチャネルの限界を回避し、細胞内分解能を有する組織中の複数のマーカーを調査するためのワンショット光学的アプローチを提供する。一般に、パラホルムアルデヒド固定組織、凍結組織、およびホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ヒト組織を含む標準的な組織調製物と適合性があります。このプラットフォームは、特に厚い無傷の組織について、生物学的標本のタンパク質相互作用のより包括的な全体像を提供すると想定しています。このプロトコルは、抗体調製から組織サンプル染色、SRS顕微鏡アセンブリ、epr-SRS組織イメージングまでのワークフローを提供します。
Introduction
複雑な組織系は、空間的位置および相互作用ネットワークがそれらの機能および機能不全と深く絡み合っている別個の細胞亜集団から構成される1,2。組織構造を明らかにし、その複雑さを調べるためには、単一細胞分解能でのタンパク質の空間的位置の知識が不可欠です。したがって、高度に多重化されたタンパク質イメージング技術はますます高く評価されており、組織生物学を研究するための礎石になる可能性があります3,4,5。現在の一般的な多重化タンパク質イメージング方法は、2つの主要なカテゴリに分類することができる。1つは、組織染色およびイメージングの複数回のラウンドに依存する連続免疫蛍光イメージングであり、もう1つは、重金属タグ付き抗体6、7、8、9、10、11、12と結合されたイメージングマスサイトメトリーである。
ここでは、多重化抗体ベースのタンパク質イメージングのための代替戦略が導入される。広い励起スペクトルと発光スペクトル(半値全幅(FWHM)〜500cm-1)のために同時に4〜5チャンネルしか視覚化できない一般的な蛍光イメージングモダリティとは異なり、ラマン顕微鏡ははるかに狭いスペクトル線幅(FWHM〜10cm-1)を示し、スケーラブルな多重性を提供します。最近、狭いスペクトルを利用することによって、電子事前共鳴刺激ラマン散乱(epr−SRS)顕微鏡法と名付けられたラマン顕微鏡の新規なスキームが開発され、多重化画像化のための強力な戦略を提供する13。epr-SRSは、ラマン色素の電子的に結合された振動モードをプローブすることにより、ラマン断面に対して10 13倍の劇的な増強効果を達成し、従来のラマン顕微鏡(図1A)13、14、15の感度ボトルネックを克服します。その結果、epr-SRSの検出限界はサブμMに押され、細胞内の特定のタンパク質や細胞小器官などの興味深い分子マーカーのラマン検出が可能となった13,16。特に、ラマン色素結合抗体を利用して、細胞および組織中の特定のタンパク質のepr-SRSイメージング(免疫-eprSRSと呼ばれる)が、標準的な免疫蛍光に対して同等の感度で実証されました(図1B)13、17。ポンプの波長をわずか2nmだけ同調させることで、epr-SRS信号は完全にオフになり(図1B)、高い振動コントラストを示します。
プローブ側では、抗体コンジュゲーション13、18、19、20のためにマンハッタンラマン散乱(MARS)色素と呼ばれる虹のようなラマンプローブのセットが開発されている。このユニークなラマンパレットは、π共役三重結合を持つ新規色素(補足資料)で構成され、それぞれが生体直交ラマンスペクトル範囲で単一の狭いepr-SRSピークを表示します(図1C)。コア発色団の構造を改変し、三重結合の両原子を同位体編集することにより(補足資料)、スペクトル的に分離されたラマンプローブが開発されている。スケーラブルな多重性を活用して、MARS色素パレットと組み合わせたepr-SRS顕微鏡は、細胞および組織におけるワンショット多重タンパク質イメージングのための光学戦略を提供します。
Immuno-eprSRSは、独自の強みを持つ現在のマルチプレックスタンパク質イメージング法に代わる戦略を提供します。周期的な染色、イメージング、シグナル除去による蛍光アプローチと比較して、このラマンベースのプラットフォームは、シングルラウンド染色とイメージングを保証します。したがって、巡回手順の実際的な複雑さを回避し、プロトコルを大幅に簡素化し、多重化タンパク質イメージングの新しい領域を開きます。例えば、ラマン色素に合わせた組織透明化プロトコルを利用して、免疫eprSRSは3次元に拡張され、厚いインタクト組織における高度に多重化されたタンパク質マッピングが可能になりました17。10以上のタンパク質標的を、厚さミリメートルのマウス脳組織に沿って可視化した17。より最近では、免疫eprSRSを最適化された生体分子保持膨張顕微鏡(ExM)プロトコル21と結合させることで、複数の標的のワンショットナノスケールイメージングも実証されている22。イメージング質量分析法4,9と比較して、epr-SRSは非破壊的であり、本質的に光学的切断能力を有する。さらに、epr-SRSは、組織スキャンにおいてより時間効率が良い。通常、ピクセルサイズが0.5μmの0.25mm2の組織領域は、単一のepr-SRSチャネルの画像化に数分しかかかりません。例えば、図4の4つのSRSチャネルと4つの蛍光チャネルの合計イメージング時間は約10分である。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、新しく保存されたマウス組織、FFPEヒト組織、および凍結マウス組織を含む一般的な組織タイプに広く適用可能な免疫eprSRSプロトコルを提示する。免疫-eprSRSは、表1に列挙されているように、細胞および組織におけるエピトープのパネルについて検証されている。このワンショットプラットフォームは、サイクリック戦略がうまく機能しないアプリケーションに特に適?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
マウスの膵臓組織を提供してくれたルース・A・シンガーとリチャード・K・P・ベニンガーに感謝します。W.M.は、NIH R01(GM128214)、R01(GM132860)、R01(EB029523)、および米軍(W911NF-19-1-0214)からのサポートを認めています。
Materials
| 16% Paraformaldehyde, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | Primary antibodies |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | BioLegend | 657402 | Primary antibodies |
| β-III-tubulin | Abcam | ab41489 | Primary antibodies |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | Primary antibodies |
| Agarose, low gellling temperature | Sigma Aldrich | A9414 | For brain embedding |
| Anti-a-tubulin antibody produced in rabbit (α-tubulin) | Abcam | ab52866 | Primary antibodies |
| Anti-Calbindin antibody produced in mouse (Calbindin) | Abcam | ab82812 | Primary antibodies |
| Anti-GABA B receptor R2 antibody produced in guinea pig (GABA B receptor R2) | Millipore Sigma | AB2255 | Primary antibodies |
| Anti-GFAP antibody produced in goat (GFAP) | Thermo Scientific | PA5-18598 | Primary antibodies |
| Anti-Glucagon antibody produced in mouse (Glucagon) | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| Anti-insulin antibody produced in guinea pig (insulin) | DAKO | IR00261-2 | Primary antibodies |
| Anti-MBP antibody produced in rat (MBP) | Abcam | ab7349 | Primary antibodies |
| Anti-NeuN antibody produced in rabbit (NeuN) | Thermo Scientific | PA5-78639 | Primary antibodies |
| Anti-Pancreatic polypeptide (PP) antibody produced in goat- Pancreatic polypeptide (PP) | Sigma Aldrich | SAB2500747 | Primary antibodies |
| Anti-Pdx1 antibody produced in rabbit (Pdx1) | Milipore | 06-1379 | Primary antibodies |
| Anti-Somatostatin antibody produced in rat (Somatostatin) | Abcam | ab30788 | Primary antibodies |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken (Vimentin) | Abcam | ab24525 | Primary antibodies |
| Band-pass filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male / Male |
| Broadband dielectric mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Centrifuge | |||
| Condenser | Olympus | oil immersion, 1.4 N.A. | |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab7797 | Primary antibodies |
| Cytokeratin 18 | Abcam | ab24561 | Primary antibodies |
| DC power supply | TopWard | 6302D | Bias voltage is 64 V |
| Dichroic mount | Thorlabs | KM100CL | Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Left Handed |
| Donkey anti-Chicken IgY (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 703-005-155 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-005-151 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-005-152 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| Donkey anti-Sheep IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 713-005-147 | Secondary antibodies for MARS conjugation |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | Primary antibodies |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 443611 | |
| Fast-speed look-in amplifier | Zurich Instruments | HF2LI | DC – 50 MHz |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Fibrillarin | Abcam | ab5821 | Primary antibodies |
| Giantin | Abcam | ab24586 | Primary antibodies |
| Glucagon | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | Primary antibodies |
| H2B | Abcam | ab1790 | Primary antibodies |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| High O.D. bandpass filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
| Hydrophobic pen | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| Insulin | ThermoFisher | 701265 | Primary antibodies |
| Integrated SRS laser system | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse train at 1,064 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1,064-nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulse trains is achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
| Inverted laser-scanning microscope | Olympus | FV1200MPE | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| Long-pass dichroic beam splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | Primary antibodies |
| Microscopy imaging software | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant Plate | Tecan | For absorbance-based, small volume analyses in a plate reader. | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Thermo Scientific | R37606 | |
| Nunc 4-Well Dishes | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| Objective lens | Olympus | XLPlan N | x25, 1.05-NA, MP, working distance = 2 mm |
| Paint brush | |||
| Periscope assembly | Thorlabs | RS99 | includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
| pH meter | |||
| Plate reader | Tecan | Infinite 200 PRO | An easy-to-use multimode plate reader. Absorbance measurement capabilities over a spectral range of 230–1000 nm. |
| ProLong Gold antifade reagent | Thermo Scientific | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | Primary antibodies |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | gel filtration resin for desalting and buffer exchange |
| Shielded box with BNC connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box With Cover, BNC Female/Female |
| Si photodiode | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 nm, 10 mm x 10 mm Active Area |
| Synapsin 2 | ThermoFisher | OSS00073G | Primary antibodies |
| Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides | Fisher Scientific | 22-035813 | Adhesive slide to attract and chemically bond fresh or formalin-fixed tissue sections firmly to the slide surface (tiisue bindling glass slides) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 | |
| Vimentin | Abcam | ab8069 | Primary antibodies |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
Referências
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