혜성 분석은 DNA 손상을 감지하는 널리 사용되는 수단입니다. 이 연구는 혜성 분석의 대표적인 변형에서 슬라이드를 실행하는 접근 방식을 설명합니다. 이 접근 방식은 샘플 수를 크게 늘리는 동시에 분석 실행 시간, 슬라이드 조작 횟수 및 젤 손상 위험을 줄였습니다.
세포는 내부 및 외부 환경에서 발생하는 물질에 지속적으로 노출되어 DNA를 손상시킬 수 있습니다. 이러한 손상은 비정상적인 세포 기능을 유발할 수 있으므로 DNA 손상은 암, 신경 퇴행성 및 심혈관 질환 및 노화와 같은 모든 주요 인간 질병의 발병에 중요한 역할을 할 수 있습니다. 단일 세포 겔 전기 영동 (즉, 혜성 분석)은 광범위한 유형의 DNA 손상 (예 : 단일 및 이중 가닥 절단, 알칼리 불안정 부위, DNA-DNA 가교 결합 및 특정 복구 효소, 산화 퓨린 및 피리 미딘과 조합)의 형성 및 복구를 연구하는 가장 일반적이고 민감한 방법 중 하나입니다. 시스템. 그러나 기존 분석의 낮은 시료 처리량과 힘든 시료 정밀 검사는 가능한 가장 광범위한 적용에 대한 제한 요소입니다. 혜성의 “채점”이 점점 자동화됨에 따라 한계는 이제 상당한 수의 혜성 슬라이드를 처리하는 능력입니다. 여기에서 혜성 분석(HTP 혜성 분석)의 고처리량(HTP) 변형이 개발되어 분석되는 샘플 수가 크게 증가하고 분석 실행 시간, 개별 슬라이드 조작 횟수, 시약 요구 사항 및 겔의 물리적 손상 위험이 크게 감소합니다. 또한, 전기 영동 탱크의 설치 공간은 슬라이드의 수직 방향과 일체형 냉각으로 인해 크게 감소합니다. 또한 여기에보고 된 것은 혜성 분석 슬라이드를 냉각시키는 새로운 접근법으로, 혜성 겔의 응고를 편리하고 효율적으로 촉진합니다. 여기서, 대표적인 혜성 분석 방법에 이들 장치의 적용이 설명되었다. 이러한 간단한 혁신은 혜성 분석의 사용과 노출 생물학, 생태 독성학, 생물 모니터링, 독성 스크리닝 / 테스트와 같은 연구 분야에 대한 적용과 병인 이해를 크게 지원합니다.
세포는 내부 및 외부 환경에서 발생하는 작용제에 지속적으로 노출되어 DNA 1,2를 손상시킬 수 있습니다. 이러한 손상은 비정상적인 세포 기능3을 유발할 수 있으며, 따라서 DNA 손상은 암, 신경퇴행성 및 심혈관 질환, 노화4와 같은 많은 주요 인간 질병의 발병에 중요한 역할을 할 수있다. 혜성 분석(단일 세포 겔 전기영동이라고도 함)은 세포 DNA 손상을 감지하고 정량화하는 데 점점 더 널리 사용되는 방법입니다.
가장 간단한 알칼리성 혜성 분석(ACA)은 알칼리성 조건에서 단일 가닥 절단이 되는 아푸린/아피리미딘 부위 및 알칼리 불안정 부위(ALS)와 함께 가닥 절단(SB, 단일 및 이중 모두)을 감지합니다. 중성 pH 혜성 분석은 솔직한 단일 및 이중 가닥 파손을 평가할 수 있습니다6. 더욱이, ACA는, 다수의 DNA 복구 효소와 조합하여, 상당한 범위의 DNA 손상 유형, 예를 들어, 산화된 퓨린 (인간 8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제 1; hOGG17의 사용에 의해 확인됨); 산화된 피리미딘(엔도뉴클레아제 III 사용; EndoIII) 및 사이클로부탄피리미딘 이량체(T4 엔도뉴클레아제 V; T4엔도V)8. 혜성 분석은 또한 시스플라틴 9,10,11과 같은 가교결합제에 의해 유도된 DNA 병변을 평가하는데 사용될 수 있다. 분석의 공식 이름, 즉 단일 세포 겔 전기 영동에서 알 수 있듯이 분석은 분석중인 세포가 단일 세포 현탁액에 의존합니다. 가장 일반적으로, 이들은 배양된 세포이지만 전혈(12,13)로부터 분리될 수 있거나, 또는 전혈 자체가 사용될 수 있다(14,15). 대안적으로, 단일 세포 현탁액은 고형 조직으로부터 생성될 수 있다.
몇 가지 예외, 특히 Engleward 실험실 16의 CometChip 보고서를 제외하고, 전체 혜성 분석 프로토콜은 분석의 발명가가 원래 설명한 것과 크게 변경되지 않았습니다 (Östling and Johansson17 및 Singh etal.18). 혜성 분석에는 여러 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 단계의 대부분은 한 번에 하나의 슬라이드씩 얇은 세포 함유 아가로스 겔의 이송을 포함하므로 겔의 손상 또는 손실 위험을 초래하여 실험의 성공을 위태롭게 합니다. 결과적으로, 혜성 분석은 특히 상당한 수의 슬라이드가 실행되는 경우 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 일반적으로 최대 40개의 슬라이드가 대형(33cm x 59cm x 9cm) 전기영동 탱크에서 실행되며, 이 탱크는 냉각을 위해 습식 얼음이 들어 있는 훨씬 더 큰 트레이 안에 있습니다. 용해 단계의 지속 시간을 줄이고 염색 전에 슬라이드를 건조시키지 않음으로써 분석 런타임을 1일로 단축할 수 있다고 최근에 보고되었습니다(19).
본 저자들은 이전에 고처리량 알칼리성 혜성 분석(HTP ACA)에 대한 새로운 접근법을 보고했으며, 여기서 다중(25개의 배치) 혜성 분석 현미경 슬라이드가 혜성 분석 공정20,21,22를 통해 동시에 조작될 수 있다. 이 특허 받은 접근법은 현미경 슬라이드를 개별적으로 조작할 필요성을 제거하여 샘플 함유 겔의 손상 또는 손실 위험을 최소화하고 현미경 슬라이드를 사용하는 혜성 분석의 모든 변형에 적용할 수 있습니다. 슬라이드 포함 랙은 조작 중에 젤을 보호하므로 결과적으로 샘플 처리가 더 빠르고 효율적입니다. 슬라이드는 또한 수평 방향이 아닌 수직 방향으로 유지되는 랙에서 전기 영동을 겪을 수 있습니다. 이것과 일체형 냉각은 전기 영동 탱크의 설치 공간을 크게 줄이고 젖은 얼음의 필요성을 제거합니다. 종합하면, 이것은 기존 절차에 비해 상당한 개선을 나타냅니다. 사용된 장비는 그림 2에 나와 있습니다. 이 신규한 접근법을 사용하여, 여기에 기술된 프로토콜은, 알칼리-불안정 부위 (ALS), DNA 간 가닥 가교결합 (ICL), 및 다양한 DNA 복구 효소의 기질의 검출을 위한 배양된 세포 및 전혈(14)에 대한 대표적인 적용을 입증한다.
이 연구는 혜성 분석의 다양한 대표적인 일반적인 변이체(즉, 알칼리성, 효소 변형, 혈액 및 ICL 및 기타 변이체도 적합함)로 높은 처리량을 달성하는 데 사용할 수 있는 현재 장비가 제공하는 다기능성을 보여줍니다. 또한, 본 접근법은 몇 가지 이점을 제공합니다 20,21 : (a) 여러 슬라이드를 병렬로 조작하여 분석 실행 시간이 단축됩니다 (처리 시간60 % 감소); (b) 젤 손상 위험, 따라서 실험에 대한 위험이 감소합니다. (c) 시약 요구량이 감소한다 (예를 들어, 전기영동 탱크의 부피가 종래의 탱크보다 작음); (d) 슬라이드 실행 수가 증가합니다. 하나의 탱크는 단일 기존 탱크에 비해 슬라이드 실행 수를 20 % 증가시킬 수 있습니다. 그러나 여러 전기 영동 탱크는 동일한 전원 공급 장치에서 병렬로 실행되거나 슬레이브 (즉, 단일 전원 공급 장치로 제어되는 여러 탱크)가 가능하며 얼음 트레이가있는 단일 기존 탱크보다 작은 벤치 탑 풋 프린트가 필요합니다. (e) 슬라이드의 수직 방향과 통합 냉각으로 인해 탱크 설치 공간이 감소합니다 (실험실 공간 절약). HTP 탱크는 하나의 냉동 냉각 팩을 장착할 수 있는 슬라이딩 서랍이 있는 고성능 세라믹 냉각 베이스로 구성되어 있어 냉장실에서 공정을 수행하지 않고도 최적의 완충 온도를 유지할 수 있습니다.
또한, 당사가 개발한 냉각 플레이트는 26개의 혜성 슬라이드를 수용하고, 혜성 분석 슬라이드에서 저융점 아가로스의 신속한 응고를 가능하게 하고, 아가로스 겔이 응고된 후 슬라이드를 쉽게 검색할 수 있도록 합니다. 위의 혁신은 혜성 분석 프로세스를 더 간단하고 쉽게 만듭니다.
다른 고처리량 접근법(예: 12-겔 혜성 분석, CometChip, 또는 96 미니 겔 형식)이 개발되었지만[25), 많은 과학자들은 기존의 현미경 슬라이드(상업적으로 이용 가능한 사전 코팅된 슬라이드 또는 기타 특수 슬라이드 포함)를 사용하는 것을 선호합니다. 본 접근법은 모든 유형의 현미경 슬라이드를 수용할 수 있어서, 이러한 슬라이드를 이용한 실험이 더 빠른 슬라이드 처리 및 취급을 통해 스케일업될 수 있게 한다. 위에서 언급했듯이 HTP 혜성 시스템은 많은 이점을 제공하지만 한 가지 주목할만한 한계가 있습니다 : 현재의 접근 방식은 기존의 수평 탱크에 비해 샘플 수가 20 % 만 증가합니다 (슬라이드 처리가 훨씬 빠르지 만). CometChip 및 96 미니 젤 형식은 더 많은 수의 샘플을 실행합니다. 현재까지 우리는 현재의 접근 방식이 CometChip 또는 96 미니 젤 형식을 수용 할 수 있는지 여부를 알지 못하지만 그렇게 될 것으로 예측합니다. 위에서 언급했듯이 탱크를 단일 전원 공급 장치로 슬레이브로하여 샘플 수를 더 늘릴 수 있습니다. 모든 접근 방식과 마찬가지로 샘플을 로드하고 현미경으로 분석하는 동안 젤이 손실되거나 손상될 가능성이 여전히 있지만 이는 작업자 오류로 인한 것이며 현재 접근 방식으로는 이러한 가능성이 최소화됩니다.
HTP 혜성 시스템의 사용은 DNA 손상을 분석하는 데 크게 도움이 될 수 있으며, 분자 역학, 남성 생식 과학, 유전 독성학 연구 및 환경 독성학과 같은 광범위한 응용 분야에서 혜성 분석의 사용을 용이하게 합니다. 이는 친숙하고 비용 효율적인 기존 현미경 슬라이드에서 벗어나지 않고 처리량 향상과 사용 편의성의 모든 이점을 원하는 사용자에게 특히 해당됩니다.
The authors have nothing to disclose.
이 간행물에보고 된 연구는 부분적으로 국립 보건원의 국립 환경 건강 과학 연구소에서 수상 번호 1R41ES030274로 지원했습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |