Summary
O presente protocolo descreve uma medida contínua a longo prazo do fluxo sanguíneo renal em ratos conscientes e o registro simultâneo da pressão arterial com cateteres implantados (cheios de líquido ou por telemetria).
Abstract
Os rins desempenham um papel crucial na manutenção da homeostase dos fluidos corporais. A regulação do fluxo sanguíneo renal (RBF) é essencial para as funções vitais da filtração e metabolismo na função renal. Muitos estudos agudos têm sido realizados em animais anestesiados para medir a RBF sob várias condições para determinar os mecanismos responsáveis pela regulação da perfusão renal. No entanto, por razões técnicas, não foi possível medir a RBF continuamente (24 h/dia) em ratos não anestesiados sem restrições durante períodos prolongados. Esses métodos permitem a determinação contínua da RBF ao longo de muitas semanas, ao mesmo tempo em que registram simultaneamente a pressão arterial (PA) com cateteres implantados (cheios de líquido ou por telemetria). O monitoramento de RBF é realizado com ratos colocados em uma gaiola de ratos servo-controlada circular que permite o movimento desenfreado do rato durante todo o estudo. Ao mesmo tempo, o emaranhamento de cabos da sonda de fluxo e cateteres arteriais é impedido. Os ratos são primeiro instrumentados com uma colocação de sonda de fluxo ultra-sônica na artéria renal esquerda e um cateter arterial implantado na artéria femoral direita. Estes são encaminhados por via subcutânea para a nuca e conectados ao medidor de vazão e ao transdutor de pressão, respectivamente, para medir a RBF e a PA. Após a implantação cirúrgica, os ratos são imediatamente colocados na gaiola para se recuperar por pelo menos uma semana e estabilizar as gravações da sonda ultra-sônica. A coleta de urina também é viável nesse sistema. Os procedimentos cirúrgicos e pós-cirúrgicos para monitoramento contínuo são demonstrados neste protocolo.
Introduction
Os rins são apenas 0,5% do peso corporal, mas ricos em fluxo sanguíneo, recebendo 20%-25% do débito cardíaco total1. A regulação do fluxo sanguíneo renal (RBF) é fundamental para a função renal, fluido corporal e homeostase eletrolítica. A importância da regulação do fluxo sanguíneo para o rim é bem ilustrada pelo aumento substancial da IRC no rim remanescente após nefrectomia unilateral 2,3,4 e pelas reduções da IRC que ocorrem na insuficiência renal 5,6,7. Se tais alterações na RBF ocorrem em resposta a alterações na função renal ou uma diminuição na função devido à redução da RBF tem sido um desafio para determinar em animais anestesiados cirurgicamente preparados ou seres humanos. São necessários estudos temporais nos quais os eventos possam ser determinados antes e depois de uma mudança definida e observados no mesmo animal durante a progressão dos eventos. Nos estudos em animais e humanos, a RBF tem sido estimada indiretamente pela depuração do ácido para-aminohipúrico (HAP)8,9,10 e, em tempos mais recentes, por técnicas de imagem como ultrassonografia 9,11,12, RM4,13 e PET-CT14,15 que fornecem imagens instantâneas úteis de cada rim e que podem acompanhar a progressão da doença. É um desafio avaliar a RBF em animais de pequeno porte por ultrassonografia ou ressonância magnética sem anestesia. Tem sido impossível medir continuamente a RBF sob condições conscientes no mesmo rato durante períodos prolongados.
O presente protocolo, portanto, desenvolveu técnicas que possibilitam medidas contínuas simultâneas de 24 h/dia de eritrócitos, que foram combinadas com métodos de medida contínua da pressão arterial para ratos em movimento livre, conforme descrito anteriormente 16,17,18,19,20,21 . Esta tecnologia permite a avaliação temporal da RBF em vários modelos de ratos para estudar as relações de causa-efeito em vários distúrbios renais no futuro.
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Protocol
O protocolo é aprovado pelo Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care and Use. Ratos sensíveis ao sal de Dahl (machos e fêmeas), ~ 8 semanas de idade, 200-350 g, foram usados para os experimentos.
1. Preparação animal
- Instale um sistema de gaiola de resposta ao movimento para o rato, um módulo de fluxo perivascular, bomba de seringa, dispositivo de gravação e software (consulte Tabela de Materiais) na sala de animais.
- Coloque os ratos na gaiola para se familiarizar com o ambiente, a comida e o sistema de água pelo menos na semana anterior à cirurgia. Jejue os ratos a partir do dia anterior à cirurgia, pois um alto conteúdo estomacal pode interferir na colocação da sonda de fluxo na artéria renal esquerda e pode causar aspiração traqueal.
- Conecte uma tubulação de poliuretano de 5 cm (diâmetro interno de 0,30 mm e diâmetro externo de 0,64 mm) ao final dos 90 cm de tubulação de poliuretano (diâmetro interno 0,64 mm e diâmetro externo de 1,02 mm) com cimento de PVC para fazer um cateter arterial femoral (ver Tabela de Materiais).
- Esterilizar os cateteres com um esterilizador de óxido de etileno, a sonda de fluxo com glutaraldeído a 2,5% e os instrumentos cirúrgicos em autoclave a vapor. Limpe as mesas cirúrgicas, a microscopia e as luzes com hipoclorito de sódio a 1%.
2. Cirurgia
- Coloque a sonda RBF seguindo as etapas abaixo.
- Anestesiar os ratos com isoflurano de 2,0%-2,5% na medida em que os ratos não respondem ao estímulo da dor. Colocá-lo sobre a mesa cirúrgica a 37 °C e injectar 0,09 mg/kg de buprenorfina SR e 15 mg/kg de cefazolina (ver Tabela de Materiais) antes da cirurgia.
- Raspe todo o abdômen com um cortador elétrico e uma região na nuca ao redor da7ª vértebra cervical, onde o cateter e o fluxo provam que os fios sairão.
- Após o barbear, limpe a área com etanol a 70%, iodopovidona a 10% e novamente com etanol a 70%.
- Coloque o rato na posição prona. Faça um corte de 1 cm usando um bisturi na nuca e no flanco esquerdo. Em seguida, realize uma dissecção contundente com pinça hemostática e limpe um espaço subcutâneo da incisão do flanco até a parte de trás do pescoço.
- Passe a sonda de fluxo através deste túnel subcutâneo do pescoço para a incisão do flanco com pinça hemostática.
- Coloque o rato na posição supina. Faça uma incisão abdominal de 4-5 cm na linha média.
- Dissecar a área ao redor da artéria renal com pinças curvas para expor um espaço suficiente para colocar a sonda de fluxo (ver Tabela de Materiais). Em seguida, perfure sem rodeios o músculo quadrado lombar esquerdo com a pinça hemostática e puxe a cabeça da sonda de fluxo para a cavidade abdominal.
- Ligue a ponta da sonda de fluxo à artéria renal esquerda e ligue-a ao medidor de caudal (ver Tabela de Materiais). Adicione um pouco de gel ao redor da ponta da sonda e o valor da taxa de fluxo aparecerá no medidor de vazão.
NOTA: Embora dependa do tamanho do rato, um fluxo de cerca de 3-5 mL/min será observado em um rato de 230 g. - Cole a malha de fibra de poliéster presa à sonda com adesivo de tecido na parede abdominal e segure até secar e colar (~1-2 min). Uma vez que o fluxo esteja no lugar, desconecte a sonda de fluxo do medidor de vazão e cubra o abdômen com gaze embebida em solução salina e passe para a etapa de inserção do cateter.
- Insira o cateter femoral seguindo os passos abaixo.
NOTA: O método para inserir um cateter cheio de líquido é o mesmo que as instalações regulares de telemetria. Embora a telemetria seja preferida, o cateter arterial permite o monitoramento da pressão e a coleta de sangue do rato consciente.- Primeiro, encha o cateter com soro fisiológico e prenda-o com pinça vascular antes de fazer uma incisão cutânea de 1 cm usando um bisturi na coxa esquerda para dissecar e expor a artéria femoral. Ao bloquear o fluxo no lado proximal da artéria femoral com um fio, insira o cateter.
- Lave com uma pequena quantidade de solução salina, conecte com fio inoxidável de tamanho apropriado e amarre o cateter com um fio para fixá-lo.
- Uma vez que a ligadura é amarrada ao redor do cateter, crie um túnel subcutâneo usando um trocarte de aço inoxidável da coxa para a parte de trás do pescoço para trazer o cateter para a região do pescoço. Prenda-o com suturas de seda 3-0 colocadas no músculo trapézio.
- Suture a sonda.
- Gire o rato para a posição prona e costure o laço circular da sonda de fluxo subcutaneamente no flanco. Suture a incisão no flanco e no pescoço com sutura cirúrgica 4-0 (ver Tabela de Materiais).
- Anexe um botão de pele à sonda de fluxo e suture-o com seda 3-0 na parte de trás do pescoço.
- Conecte a sonda de fluxo ao medidor de vazão novamente, gire o rato de volta à posição dorsal para verificar a RBF e faça os ajustes finais da sonda de fluxo para otimizar sua posição na artéria renal.
- Finalmente, suture o músculo com seda 3-0 e a pele com sutura cirúrgica 4-0.
3. Recuperação do animal
- Após observação cuidadosa, até que os ratos estejam totalmente recuperados da anestesia, devolva os ratos a um sistema de enjaulamento de resposta ao movimento, conecte a sonda de fluxo ao medidor de fluxo sanguíneo e permita um período de recuperação de cerca de uma semana para estabilizar a sonda e a medição de fluxo.
NOTA: A gravação não precisa ser feita durante esse período. - Infundir solução salina heparinizada a 3% continuamente durante todo o estudo a partir do cateter arterial à taxa de 100 μL/h para evitar a coagulação.
- Quando o fluxo se estabilizar após 5-6 dias, defina a calibração do medidor de vazão para medir o fluxo sanguíneo em 0-20 mL/min e inicie o registro contínuo de RBF.
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Representative Results
Os dados de pressão arterial média (Figura 1A) e os dados de fluxo sanguíneo (Figura 1B) de um rato macho representativo sensível ao sal de Dahl são mostrados. Os ratos sensíveis ao sal de Dahl são mantidos em uma colônia e criados no Medical College of Wisconsin. A cirurgia foi feita com a idade de 8 semanas, e o peso corporal era de 249 g no momento da cirurgia. Os ratos foram alimentados com uma dieta de NaCl de 0,4%, e a dieta foi alterada para uma dieta de NaCl de 4% com a idade de 10 semanas. As medidas foram continuadas por 3 semanas em uma dieta de NaCl a 4%, e o experimento foi encerrado às 13 semanas de idade. Os dados são mostrados com uma média de minutos. Observou-se clara diferença diurna na pressão arterial média e no fluxo sanguíneo. Enquanto a pressão arterial aumenta com uma dieta rica em sal, o fluxo sanguíneo tende a diminuir em vez de aumentar, sugerindo aumento da resistência vascular renal.
Figura 1: Dados representativos da pressão arterial e do fluxo sanguíneo. A pressão arterial média (mm Hg) (A) e o fluxo sanguíneo renal (mL/min) (B) são mostrados com uma média mínima. LS: dieta com baixo teor de sal (0,4% NaCl), HS: Dieta rica em sal (4% NaCl). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo descreve uma técnica que utiliza instrumentação comercialmente disponível para registrar a RBF e a pressão arterial continuamente ao longo de muitas semanas. Além disso, a urina pode ser coletada usando o dispositivo descrito na etapa 1.1. Também pode ser usado para avaliar metabólitos na urina e, quando um cateter arterial é implantado, amostragem de sangue para análise.
Tradicionalmente, as medidas de RBF têm sido obtidas de forma aguda em animais anestesiados preparados cirurgicamente ou estimadas por depuração de HAP. No entanto, tem sido demonstrado que vários anestésicos e cirurgias22,23 alteram o fluxo sanguíneo renal e a pressão arterial. Estudos em humanos relataram que o isoflurano reduziu a depuração da HAP de 476,8-243,3 mL/min e a depuração da inulina de 88,0 para 55,7 mL/min, respectivamente8. O tiobarbital é um anestésico amplamente utilizado para estudos críticos de ratos. Ainda assim, é relatado que a produção de H2O2 nas mitocôndrias do córtex renal aumenta 90 min após a anestesia com tiobarbital24, o que pode afetar o fluxo sanguíneo. Medições em animais não anestesiados e não estressados seriam de longe preferíveis para muitos estudos experimentais. O método de mensuração da RBF por meio do implante de uma sonda de fluxo tem sido demonstrado em cães25 e ratos26. Este trabalho também estabeleceu uma forma de medir a RBF em ratos em laboratório.
A aplicação das técnicas descritas nesta apresentação pode abordar muitas questões relacionadas aos eventos sequenciais após um determinado estímulo. O modelo de rato instrumentado não anestesiado permite a determinação de respostas imediatas e crônicas à droga e consequências a longo prazo de vários estímulos que podem ocorrer durante o desenvolvimento da hipertensão.
A cirurgia envolve perda mínima de sangue com quase 100% de taxas de sobrevivência com algum treinamento. As sondas de fluxo podem ser reutilizadas após a lavagem com detergente aniônico contido em protease e esterilização após um experimento de 4 semanas. No entanto, o revestimento de plástico se deteriorará gradualmente e, após vários usos, exigirá reparo. O botão da pele no próximo onde os cateteres saem representa o problema potencial mais significativo, pois é vulnerável a infecções, irritação e arranhões se não for cuidadosamente limpo e desinfetado. No entanto, se isso se soltar, pode ser rapidamente reparado sob anestesia.
A etapa crítica do procedimento é a cirurgia, e pode demorar um pouco para dominar a técnica. No entanto, uma vez alcançados, estudos crônicos não anestesiados podem ser realizados de forma produtiva com o mínimo de problemas. É possível operar em ratos de 200-350 g, independentemente da cepa ou sexo. Experimentos em ratos de diferentes tamanhos e animais também são possíveis usando sondas de fluxo de diferentes tamanhos já preparadas pelos fabricantes.
No entanto, existem limitações e questões específicas às quais se deve prestar atenção. Primeiro, a cirurgia deve ser conduzida usando instrumentos esterilizados, cateteres e sondas de fluxo, na medida do possível, para minimizar as infecções pós-cirúrgicas. Em segundo lugar, como a cirurgia é extensa e requer mais de uma hora, um período de recuperação suficientemente longo deve ser fornecido antes de obter medidas de "controle" para o estudo. Este período em nosso laboratório geralmente se estende de 7-10 dias. Em terceiro lugar, o íleo paralítico (uma oclusão ou paralisia do intestino) tem sido um problema em alguns casos representando uma complicação pós-operatória. Isso pode ser evitado evitando a exposição do intestino (por exemplo, mantenha-se envolto em gaze úmida) durante o procedimento e evitando fechar a incisão abdominal até que a ligação esteja bem seca. É essencial evitar expor o intestino à artéria renal durante a cirurgia e garantir que o intestino não esteja torcido durante a sutura. Em quarto lugar, deve-se reconhecer que a RBF aumentará proporcionalmente com o aumento do peso renal. Isso deve ser considerado em estudos nos quais a hipertrofia renal ocorre após a remoção do rim contralateral. Quinto, só temos experiência em medir a RBF por até um mês e não tentamos estender as medições além desse período. Como as coisas estavam funcionando bem durante todo esse período em quase todos os casos, os estudos provavelmente poderiam ser estendidos muitas semanas além. Por fim, uma breve palavra sobre medidas paralelas da pressão arterial: são utilizados os cateteres implantados cheios de líquido com heparina diluída para manter a permeabilidade 24 h/dia e os aparelhos de telemetria implantados. Cada um tem vantagens e desvantagens, dependendo do design experimental e das necessidades. Por exemplo, a amostragem de sangue é possível a partir do cateter arterial se o método do cateter for escolhido, e a heparinização não é necessária para o método de telemetria. No entanto, ambos nos serviram bem durante medições de longo prazo de RBF e PA.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado por bolsas de investigação científica (P01 HL116264, RO1 HL137748). Os autores gostariam de agradecer a Theresa Kurth por seus conselhos e ajuda na manutenção do ambiente experimental como gerente de laboratório.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1RB probe | Transonic | 1RB | ultrasonic flow probe |
| Betadine | Avrio Health | povidone-iodine | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | Buprenorphine | |
| Cefazolin | APOTEX | NDC 60505 | Cefazolin |
| Crile Hemostats | Fine Surgical Instruments | 13004-14 | Hemostats for blunt dissection |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794 | Isoflurane |
| Medium Clear PVC cement | Oatey | PVC cement | |
| Mersilene polyester fiber mesh | Ethicon | polyester fiber mesh | |
| MetriCide28 | Metrex | SKU 10-2805 | 2.5% glutaraldehyde |
| Micro-Renathane 0.025 x 0.012 | Braintree Scientific | MRE 025 | use for catheter |
| MINI HYPE-WIPE | Current Technologies | #9803 | 1% sodium hypochlorite |
| Oatey Medium Clear PVC Cement | Oatey | #31018 | PVC cement |
| PHD2000 syringe pump | Harvard apparatus | 71-2000 | syringe pump |
| Ponemah software | DSI | recording software | |
| Precision 3630 Tower | Dell | Computer for recording | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1407 | a movement response caging system |
| RenaPulse High Fidelity Pressure Tubing 0.040 x 0.025 | Braintree Scientific | RPT 040 | use for catheter |
| Silicone cuff | Transonic | AAPC102 | skin button |
| Surgical lubricant sterile bacteriostatic | Fougera | 0168-0205-36 | gell for flow probe |
| Tergazyme | Alconox | protease contained anionic detergent | |
| TS420 Perivascular Flow Module | Transonic | TS420 | perivascular flow module |
| Vetbond | 3M | 1469SB | tissue adhesive |
| WinDaq software | DATAQ | recording software |
References
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