Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos
Summary
Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.
Abstract
La ubiquitilación es una modificación post-traduccional que ocurre en las células eucariotas que es crítica para la regulación de varias vías biológicas, incluida la supervivencia, proliferación y diferenciación celular. Es un proceso reversible que consiste en una unión covalente de ubiquitina al sustrato a través de una reacción en cascada de al menos tres enzimas diferentes, compuestas de E1 (enzima de activación de ubiquitina), E2 (enzima conjugante de ubiquitina) y E3 (enzima ubiquitina-ligasa). El complejo E3 juega un papel importante en el reconocimiento y ubiquitilación del sustrato. Aquí, se describe un protocolo para evaluar la ubiquitilación del sustrato en células de mamíferos utilizando la coinfección transitoria de un plásmido que codifica el sustrato seleccionado, una ubiquitina ligasa E3 y una ubiquitina etiquetada. Antes de la lisis, las células transfectadas se tratan con el inhibidor del proteasoma MG132 (carbobenzoxy-leu-leu-leucinal) para evitar la degradación proteasómica del sustrato. Además, el extracto celular se somete a inmunoprecipitación a pequeña escala (IP) para purificar el sustrato poliubiquitilado para su posterior detección por western blotting (WB) utilizando anticuerpos específicos para la etiqueta de ubiquitina. Por lo tanto, se describe un protocolo consistente y sin complicaciones para el ensayo de ubiquitilación en células de mamíferos para ayudar a los científicos a abordar la ubiquitilación de sustratos específicos y las ligasas de ubiquitina E3.
Introduction
Las modificaciones post-traduccionales (PTM) son un mecanismo importante con respecto a la regulación de proteínas, que es esencial para la homeostasis celular. La ubiquitilación de proteínas es una modificación dinámica e intrincada que crea una variedad de señales diferentes que resultan en varios resultados celulares en organismos eucariotas. La ubiquitilación es un proceso reversible que consiste en la unión de una proteína de ubiquitina que contiene 76 aminoácidos al sustrato, que se produce en una cascada enzimática compuesta por tres reacciones distintas1. El primer paso se caracteriza por la activación de la ubiquitina, que depende de una hidrólisis de ATP para formar una ubiquitina ligada al tioéster de alta energía entre la ubiquitina C-terminal y el residuo de cisteína presente en el sitio activo de la enzima E1. Posteriormente, la ubiquitina se transfiere a la enzima E2 formando un complejo similar al tioéster con la ubiquitina. Después, la ubiquitina se une covalentemente al sustrato por la E2, o más a menudo, por la enzima E3, que reconoce e interactúa con el sustrato 2,3. Ocasionalmente, las enzimas E4 (factores de elongación de la cadena de ubiquitina) son necesarias para promover el ensamblaje de la cadena de multiubiquitina3.
La ubiquitina tiene siete residuos de lisina (K6, K11, K27, K29, K33, K48 y K63), lo que permite la formación de cadenas de poliubiquitina que generan enlaces distintos para producir diferentes estructuras tridimensionales que van a ser reconocidas por varias proteínas efectoras 4,5. Por lo tanto, el tipo de cadena de poliubiquitina introducida en el sustrato es esencial para decidir su destino celular 6,7,8. Además, el sustrato también podría ser ubiquitinado a través de sus residuos N-terminales llamados N-degrons. Las ubiquitinas-ligasas específicas E3 son responsables del reconocimiento de N-degron, lo que permite la poliubiquitilación del residuo de lisina cercano9.
Hoy en día, hay más de 40 sustratos diferentes específicos de SCF caracterizados. Entre ellos, se pueden encontrar reguladores clave de varias vías biológicas, incluida la diferenciación y el desarrollo celular, así como la supervivencia y la muerte celular, 10,11,12,13. Por lo tanto, la identificación de sustratos específicos de cada ubiquitina-ligasa E3 es esencial para diseñar un mapa completo de diversos eventos biológicos. A pesar de que la identificación de sustratos verdaderos es bioquímicamente desafiante, el uso de métodos basados en la bioquímica es muy adecuado para evaluar la especificidad de la cadena y la distinción entre mono y poliubiquitilación14. Este estudio describe un protocolo completo para el ensayo de ubiquitilación utilizando la línea celular de mamíferos HEK293T que sobreexpresa el sustrato UXT-V2 (isoforma 2 de chaperona similar a la prefoldina expresada ubicuamente) con el complejo E3 ubiquitina-ligasa SCF (Fbxo7). UXT-V2 es un cofactor esencial para la señalización de NF-κB, y una vez que esta proteína es derribada en las células, inhibe la activación de NF-κB inducida por TNF-α11. Así, para detectar UXT-V2 poliubiquitilado, se utiliza el inhibidor del proteasoma MG132 ya que tiene la capacidad de bloquear la actividad proteolítica de la subunidad 26S del complejo proteasoma15. Además, el extracto celular se somete a una IP a pequeña escala para purificar el sustrato, utilizando un anticuerpo específico inmovilizado a resina de agarosa para su posterior detección por WB utilizando anticuerpos seleccionados. Este protocolo es muy útil para validar la ubiquitilación del sustrato en el entorno celular, y también se puede adaptar para diferentes tipos de células de mamíferos y otros complejos de ubiquitina-ligasa E3. Sin embargo, es necesario validar el sustrato probado a través de un ensayo de ubiquitilación in vitro también, ya que ambos protocolos se complementan entre sí en cuanto a la identificación de sustratos verdaderos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ubiquitilación es una modificación post-traduccional esencial que regula los niveles de varias proteínas y desempeña un papel crucial en muchas vías de señalización y procesos biológicos, asegurando un entorno intracelular saludable. El sistema ubiquitina-proteasoma (SAI) es uno de los principales focos de la investigación farmacéutica reciente, proporcionando la posibilidad de estabilizar supresores tumorales o inducir la degradación de productos oncogénicos22. Por ejemplo, la prol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T cuenta con el apoyo de la subvención FAPESP número 2020/15771-6 y CNPq Universal 405836/2018-0. P.M.S.P y V.S son compatibles con CAPES. C.R.S.T.B.C fue apoyado por la beca FAPESP número 2019/23466-1. Agradecemos a Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0) por el apoyo material.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
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