포유동물 세포 용해물에서 E3 유비퀴틴-리가아제에 의한 기질 유비퀴틸화의 평가
Summary
우리는 포유동물 세포에서 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화 검정을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다. HEK293T 세포주는 단백질 과발현을 위해 사용되었고, 폴리유비퀴틸화된 기질은 면역침전에 의해 세포 용해물로부터 정제되고, SDS-PAGE에서 분해되었다. 면역블롯팅은 이러한 번역 후 변형을 시각화하기 위해 사용되었다.
Abstract
유비퀴틸화는 진핵 세포에서 발생하는 번역 후 변형으로, 세포 생존, 증식 및 분화를 포함한 여러 생물학적 경로의 조절에 중요합니다. E1 (유비퀴틴 활성화 효소), E2 (유비퀴틴 접합 효소) 및 E3 (유비퀴틴 리가아제 효소)로 구성된 적어도 3 가지 효소의 캐스케이드 반응을 통해 기질에 유비퀴틴을 공유적으로 부착하는 가역적 인 과정입니다. E3 복합체는 기질 인식 및 유비퀴틸화에 중요한 역할을 한다. 여기서, 선택된 기질을 코딩하는 플라스미드, E3 유비퀴틴 리가아제, 및 태그된 유비퀴틴의 일시적 공동형질감염을 사용하여 포유동물 세포에서 기질 유비퀴틸화를 평가하기 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 용해 전에, 형질감염된 세포는 기질 프로테아좀 분해를 피하기 위해 프로테아좀 억제제 MG132 (카르보벤즈옥시-류-류-류알)로 처리된다. 또한, 세포 추출물은 유비퀴틴 태그에 특이적인 항체를 사용하는 웨스턴 블롯팅(WB)에 의한 후속 검출을 위해 폴리유비퀴틸화된 기질을 정제하기 위해 소규모 면역침전(IP)에 제출된다. 따라서, 포유동물 세포에서 유비퀴틸화 분석을 위한 일관되고 복잡하지 않은 프로토콜이 과학자들이 특정 기질 및 E3 유비퀴틴 리가아제의 유비퀴틸화를 다루는 것을 돕기 위해 기술된다.
Introduction
번역 후 변형 (PTMs)은 세포 항상성에 필수적인 단백질 조절과 관련된 중요한 메커니즘입니다. 단백질 유비퀴틸화는 진핵 생물에서 여러 가지 세포 결과를 초래하는 다양한 신호의 구색을 생성하는 역동적이고 복잡한 변형입니다. 유비퀴틸화는 76개의 아미노산을 함유하는 유비퀴틴 단백질을 기질에 부착시키는 것으로 이루어진 가역적 과정으로, 세 가지 별개의 반응으로 구성된 효소적 캐스케이드에서 발생한다1. 첫 번째 단계는 유비퀴틴 활성화를 특징으로 하는데, 이는 E1 효소의 활성 부위에 존재하는 유비퀴틴 C 말단과 시스테인 잔기 사이에 고에너지 티오에스테르 결합 유비퀴틴을 형성하기 위해 ATP 가수분해에 의존한다. 이어서, 유비퀴틴은 E2 효소로 전달되어 유비퀴틴과 티오에스테르-유사 복합체를 형성한다. 그 후, 유비퀴틴은 E2에 의해 기질에 공유적으로 부착되거나, 또는 더 자주, 기질 2,3을 인식하고 상호작용하는 E3 효소에 의해 공유된다. 때때로, E4 효소 (유비퀴틴 사슬 신장 인자)는 다중 유비퀴틴 사슬 조립을 촉진하기 위해필요하다 3.
유비퀴틴은 7개의 리신 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48 및 K63)를 가지고 있어, 몇몇 이펙터 단백질 4,5에 의해 인식될 상이한 삼차원 구조를 생성하기 위해 별개의 결합을 생성하는 폴리유비퀴틴 사슬의 형성을 허용한다. 따라서, 기질에 도입된 폴리유비퀴틴 사슬의 종류는 그의 세포 운명 6,7,8을 결정하는 데 필수적이다. 더욱이, 기질은 또한 N-데그론(N-degrons)이라고 불리는 그의 N 말단 잔기를 통해 유비퀴틴화될 수 있다. 특정 E3 유비퀴틴-리가아제는 N-데그론 인식을 담당하며, 근처의 리신 잔기9의 폴리유비퀴틸화를 허용한다.
요즘에는 40 개 이상의 SCF 특정 기판이 특징입니다. 그 중에서도 세포 분화 및 발달뿐만 아니라 세포 생존 및 사망을 포함한 여러 생물학적 경로의 주요 조절인자는10,11,12,13을 찾을 수 있습니다. 따라서, 각 E3 유비퀴틴-리가아제의 특정 기질의 확인은 다양한 생물학적 사건에 대한 포괄적인 지도를 설계하는데 필수적이다. 진정한 기질의 확인이 생화학적으로 도전적이더라도, 생화학 기반 방법의 사용은 사슬 특이성과 모노- 및 폴리유비퀴틸화 사이의 구별을 평가하는데 매우 적합하다(14). 본 연구는 E3 유비퀴틴-리가아제 복합체 SCF(Fbxo7)와 함께 기질 UXT-V2(유비쿼터스로 발현된 프리폴딘-유사 샤페론 이소폼 2)를 과발현하는 포유동물 세포주 HEK293T를 이용한 유비퀴틸화 분석을 위한 완전한 프로토콜을 기술한다. UXT-V2는 NF-κB 신호전달에 필수적인 보조인자이며, 일단 이 단백질이 세포에서 녹다운되면, TNF-α-유도된 NF-κB 활성화(11)를 억제한다. 따라서, 폴리유비퀴틸화된 UXT-V2를 검출하기 위해, 프로테아좀 억제제 MG132는 프로테아좀 복합체15의 26S 서브유닛의 단백질 분해 활성을 차단하는 능력을 갖기 때문에 사용된다. 더욱이, 세포 추출물은 기질을 정제하기 위해 소규모 IP에 제출되고, 선택된 항체를 사용하여 WB에 의한 후속 검출을 위해 아가로스 수지에 고정화된 특이적 항체를 이용한다. 이 프로토콜은 세포 환경에서 기질 유비퀴틸화를 검증하는데 매우 유용하며, 또한 상이한 유형의 포유동물 세포 및 다른 E3 유비퀴틴-리가아제 복합체에 적응될 수 있다. 그러나, 시험관내 유비퀴틸화 분석을 통해 시험된 기질을 검증할 필요가 있는데, 이는 두 프로토콜 모두 진정한 기질의 확인과 관련하여 서로를 보완하기 때문이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유비퀴틸화는 여러 단백질의 수준을 조절하고 많은 신호 전달 경로와 생물학적 과정에서 중요한 역할을하여 건강한 세포 내 환경을 보장하는 번역 후 필수적인 변형입니다. 유비퀴틴-프로테아좀 시스템(UPS)은 최근 제약 연구의 주요 초점 중 하나로서, 종양 억제제를 안정화시키거나 종양원성 생성물(22)의 분해를 유도할 수 있는 가능성을 제공한다. 예를 들어, 다발성 골수종 (MM)…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
F.R.T는 FAPESP 보조금 번호 2020/15771-6 및 CNPq 유니버설 405836/2018-0에서 지원됩니다. P.M.S.P 및 V.S는 CAPES에서 지원됩니다. C.R.S.T.B.C는 FAPESP 장학금 번호 2019/23466-1의 지원을 받았습니다. 재료 지원에 대한 Sandra R. C. Maruyama (FAPESP 2016/20258-0)에게 감사드립니다.
Materials
| 1.5 mL microtube | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm TC-treated culture dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL tube | Corning | 430766 | |
| 96-well plate | Cralplast | 655111 | |
| Agarose-anti-HA beads | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| Anti Mouse antibody | Seracare | 5220-0341 | Goat anti-Mouse IgG |
| Anti Rabbit antibody | Seracare | 5220-0337 | Goat anti-Rabbit IgG |
| Anti-Actin antibody | Sigma-Aldrich | A3853 | Dilution used: 1:2000 |
| Anti-Fbxo7 antibody | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H3663 | Dilution used: 1:1000 |
| Anti-Myc antibody | Cell Signalling | 2272 | Dilution used: 1:1000 |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | Bovine Serum Albumin |
| Cell incubator | Nuaire | NU-4850 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | 500 x g for 5 min |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| Digital pH meter | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | 10-017-CRV | High glucose |
| Fetal bovine serum | Gibco | F4135 | Filtrate prior use |
| HA peptide | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline rotator | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4 (Ortovanadato) | |||
| NaF | |||
| Nitrocellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40 (IGEPAL CA-630) | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| Optical microscope | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | For mammalian expression |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 2xFlag (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI. Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag HA (C-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | Kindly donated by Dr. Marcelo Damário | Tag 6x-His-Myc (N-terminal). Restriction enzymes: EcoRI and KpnI | |
| Pen Strep Glutamine 100x | Gibco | 10378-016 | |
| Phosphate buffered saline 10x | AccuGENE | 51226 | To obtain a 1x PBS, dilute the 10x PBS into ultrapure water |
| Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| Ponceau S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| Protease inhibitor cocktail SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Rocking Shaker | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE system | BioRad | 165-8004 | |
| Solution Homogenizer | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| Trypsine (TrypLe Express) | Gibco | 12605-028 | |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
Referências
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