Valutazione dell'ossidazione del substrato energetico in vitro con 14INtrappolamento di CO 2
Summary
Questo protocollo descrive un metodo facile da usare per esaminare l’ossidazione del substrato monitorando la produzione di 14CO2 in vitro.
Abstract
I mitocondri ospitano i macchinari per il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) e la catena di trasporto degli elettroni (ETC), che generano adenosina trifosfato (ATP) per mantenere l’omeostasi energetica. Glucosio, acidi grassi e amminoacidi sono i principali substrati energetici che alimentano la respirazione mitocondriale nella maggior parte delle cellule somatiche. L’evidenza mostra che diversi tipi di cellule possono avere una netta preferenza per determinati substrati. Tuttavia, l’utilizzo del substrato da parte di varie cellule nello scheletro non è stato studiato in dettaglio. Inoltre, poiché il metabolismo cellulare è in sintonia con i cambiamenti fisiologici e fisiopatologici, le valutazioni dirette della dipendenza dal substrato nelle cellule scheletriche possono fornire importanti informazioni sulla patogenesi delle malattie ossee.
Il seguente protocollo si basa sul principio del rilascio di anidride carbonica dalle molecole del substrato dopo fosforilazione ossidativa. Utilizzando substrati contenenti atomi di carbonio marcati radioattivamente (14C), il metodo fornisce un saggio sensibile e facile da usare per il tasso di ossidazione del substrato in coltura cellulare. Un caso di studio con preosteoblasti calvariali primari rispetto a macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM) dimostra un diverso utilizzo dei substrati principali tra i due tipi di cellule.
Introduction
La fosforilazione ossidativa (OXPHOS) negli eucarioti è il processo attraverso il quale i nutrienti vengono scomposti all’interno dei mitocondri per rilasciare energia chimica sotto forma di ATP attraverso il consumo di ossigeno. Il catabolismo di vari substrati all’interno dei mitocondri attraverso il ciclo dell’acido tricarbossilico (TCA) genera direttamente poche molecole di ATP, ma piuttosto immagazzina energia attraverso la riduzione dei portatori di elettroni nicotinamide adenina dinucleotide (NAD +) e flavina adenina dinucleotide (FAD +). I portatori ridotti vengono quindi ossidati da ETC situati sulla membrana interna dei mitocondri per generare un gradiente di concentrazione protonica attraverso la membrana. I protoni alla fine fluiscono lungo il loro gradiente nella matrice mitocondriale attraverso l’ATP sintasi per produrre ATP. OXPHOS è il mezzo più efficiente di produzione di ATP da substrati energetici e generalmente preferito in ambienti aerobici. In precedenza, la glicolisi aerobica – produzione di lattato dal glucosio mentre l’ossigeno è presente – era ritenuta fisiopatologica, spesso un segno distintivo delle cellule tumorali. Sempre di più, si sta scoprendo che alcuni tipi di cellule normali usano la glicolisi aerobica per ragioni che devono ancora essere completamente decifrate.
La flessibilità metabolica è la capacità delle cellule o degli organismi di adattarsi alle mutevoli richieste di energia e alle fonti di combustibile disponibili. Ad esempio, la domanda energetica del muscolo scheletrico è soddisfatta principalmente da OXPHOS allo stato stazionario, ma dalla glicolisi anaerobica durante l’esercizio ad alta intensità1. Con l’aumentare della durata dell’esercizio, l’ossidazione del glucosio e degli acidi grassi contribuisce maggiormente alla produzione complessiva di energia2. Tuttavia, l’uso del substrato non dipende solo dalla disponibilità, poiché i substrati competono antagonisticamente durante l’ossidazione. In particolare, l’ossidazione degli acidi grassi ha dimostrato di inibire l’utilizzo del glucosio da parte del muscolo scheletrico in un fenomeno noto come effetto Randle3. Un effetto reciproco è stato dimostrato da studi successivi 4,5. Inoltre, molte malattie sono associate a un cambiamento nella preferenza del substrato e allo sviluppo di inflessibilità metabolica nelle cellule. Ad esempio, l’ossidazione degli acidi grassi è ridotta nel muscolo scheletrico dei pazienti diabetici di tipo II rispetto ai normali soggetti di controllo6. I cambiamenti metabolici nelle impostazioni della malattia sono oggetto di intense indagini in quanto possono contribuire alla patogenesi.
Il metabolismo energetico nei tipi di cellule scheletriche è relativamente poco studiato, ma ha attirato l’attenzione negli ultimi anni7. Lavori precedenti hanno dimostrato che la glicolisi aerobica è la via energetica dominante negli osteoblasti calvariali, mentre l’ossidazione del glucosio attraverso il ciclo TCA svolge un ruolo nella formazione degli osteoclasti 8,9. Altri hanno fornito prove per gli acidi grassi come fonte di energia per gli osteoblasti10. Il catabolismo della glutammina ha anche dimostrato di supportare la differenziazione degli osteoblasti dai progenitori11,12. Tuttavia, manca ancora una comprensione completa dell’utilizzo del substrato da parte di vari tipi di cellule scheletriche. Inoltre, si prevede che i cambiamenti nel metabolismo cellulare durante la differenziazione cellulare o in risposta a segnali patologici alterino l’utilizzo del substrato del carburante. Di seguito è descritto un protocollo di facile utilizzo per l’analisi dell’ossidazione del substrato in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo fornisce un metodo facile da usare per determinare il tasso di ossidazione dei principali substrati energetici. È un’alternativa più semplice ad altri protocolli che utilizzano palloni contenenti un pozzo centrale e ricoperti da tappi di gomma 14,15,16. Sebbene lo studio di esempio qui sia eseguito con coltura cellulare, il metodo può essere facilmente adattato per espianti tissutali o omogeneizzati tissutali co…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto in parte dalla sovvenzione NIH R01 AR060456 (FL). Ringraziamo il Dr. Michael Robinson ed Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) per il loro generoso aiuto con il contatore di scintillazione.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
Referências
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
