تقييم أكسدة الركيزة الطاقة في المختبر مع 14CO2 Trapping
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة سهلة الاستخدام لفحص أكسدة الركيزة عن طريق تتبع إنتاج 14CO2 في المختبر.
Abstract
تستضيف الميتوكوندريا آلية دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل (TCA) وسلسلة نقل الإلكترون (ETC) ، والتي تولد الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) للحفاظ على توازن الطاقة. الجلوكوز والأحماض الدهنية والأحماض الأمينية هي ركائز الطاقة الرئيسية التي تغذي التنفس الميتوكوندريا في معظم الخلايا الجسدية. تشير الأدلة إلى أن أنواع الخلايا المختلفة قد يكون لها تفضيل واضح لبعض الركائز. ومع ذلك ، لم تتم دراسة استخدام الركيزة من قبل الخلايا المختلفة في الهيكل العظمي بالتفصيل. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الأيض الخلوي متناغم مع التغيرات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية ، فإن التقييمات المباشرة لاعتماد الركيزة في الخلايا الهيكلية قد توفر رؤى مهمة حول التسبب في أمراض العظام.
يعتمد البروتوكول التالي على مبدأ إطلاق ثاني أكسيد الكربون من جزيئات الركيزة بعد الفسفرة التأكسدية. باستخدام ركائز تحتوي على ذرات كربون موسومة إشعاعيا (14درجة مئوية) ، توفر الطريقة فحصا حساسا وسهل الاستخدام لمعدل أكسدة الركيزة في زراعة الخلايا. توضح دراسة حالة مع الخلايا النجمية الأولية قبل العظمية مقابل البلاعم المشتقة من نخاع العظام (BMMs) استخداما مختلفا للركائز الرئيسية بين نوعي الخلايا.
Introduction
الفسفرة التأكسدية (OXPHOS) في حقيقيات النوى هي العملية التي يتم من خلالها تكسير العناصر الغذائية داخل الميتوكوندريا لإطلاق الطاقة الكيميائية في شكل ATP من خلال استهلاك الأكسجين. إن هدم الركائز المختلفة داخل الميتوكوندريا من خلال دورة حمض ثلاثي الكربوكسيل (TCA) يولد عددا قليلا من جزيئات ATP مباشرة ، ولكنه يخزن الطاقة من خلال تقليل حاملات الإلكترونات نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NAD+) وفلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (FAD +). ثم تتأكسد الناقلات المخفضة بواسطة ETC الموجود على الغشاء الداخلي للميتوكوندريا لتوليد تدرج تركيز البروتون عبر الغشاء. تتدفق البروتونات في النهاية إلى أسفل تدرجها مرة أخرى إلى مصفوفة الميتوكوندريا من خلال سينثاز ATP لإنتاج ATP. OXPHOS هي الوسيلة الأكثر كفاءة لإنتاج ATP من ركائز الطاقة ويفضل عموما في البيئات الهوائية. في السابق ، كان يعتقد أن تحلل السكر الهوائي – إنتاج اللاكتات من الجلوكوز أثناء وجود الأكسجين – هو فيزيولوجي مرضي ، وغالبا ما يكون سمة مميزة للخلايا السرطانية. يتم اكتشاف المزيد والمزيد من أن بعض أنواع الخلايا الطبيعية تستخدم تحلل السكر الهوائي لأسباب لم يتم فك رموزها بالكامل بعد.
المرونة الأيضية هي قدرة الخلايا أو الكائنات الحية على التكيف مع متطلبات الطاقة المتغيرة ومصادر الوقود المتاحة. على سبيل المثال ، يتم تلبية الطلب النشط على العضلات الهيكلية بشكل رئيسي بواسطة OXPHOS في حالة مستقرة ولكن عن طريق تحلل السكر اللاهوائي أثناء التمرين عالي الكثافة1. مع زيادة مدة التمرين ، تساهم أكسدة الجلوكوز والأحماض الدهنية بشكل أكبر في إنتاج الطاقة الكلي2. ومع ذلك ، فإن استخدام الركيزة لا يعتمد فقط على التوافر ، حيث تتنافس الركائز بشكل عدائي أثناء الأكسدة. وعلى الأخص ، ثبت أن أكسدة الأحماض الدهنية تمنع استخدام الجلوكوز بواسطة العضلات الهيكلية في ظاهرة تعرف باسم تأثير راندل3. وقد ثبت وجود تأثير متبادل من خلال الدراسات اللاحقة 4,5. بالإضافة إلى ذلك ، ترتبط العديد من الأمراض بتغيير في تفضيل الركيزة وتطوير عدم المرونة الأيضية في الخلايا. على سبيل المثال ، يتم تقليل أكسدة الأحماض الدهنية في العضلات الهيكلية لمرضى السكري من النوع الثاني مقارنة بموضوعات التحكم العادية6. التغيرات الأيضية في إعدادات المرض هي موضوع تحقيق مكثف لأنها قد تسهم في الإمراض.
استقلاب الطاقة في أنواع الخلايا الهيكلية غير مدروس نسبيا ولكنه اكتسب الاهتمام في السنوات الأخيرة7. أظهرت الأبحاث السابقة أن تحلل السكر الهوائي هو مسار الطاقة المهيمن في الخلايا العظمية الكلفارية، في حين أن أكسدة الجلوكوز من خلال دورة TCA تلعب دورا في تكوين الخلايا العظميةالعظمية 8,9. وقدم آخرون أدلة على الأحماض الدهنية كمصدر للطاقة للخلايا العظمية10. كما ثبت أن هدم الجلوتامين يدعم تمايز الأرومة العظمية عن السلف11,12. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في فهم شامل لاستخدام الركيزة من قبل أنواع مختلفة من الخلايا الهيكلية. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع أن تؤدي التغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي أثناء تمايز الخلايا أو استجابة للإشارات المرضية إلى تغيير استخدام ركيزة الوقود. الموضح أدناه هو بروتوكول سهل الاستخدام لفحص أكسدة الركيزة في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول طريقة سهلة الاستخدام لتحديد معدل أكسدة ركائز الطاقة الرئيسية. إنه بديل أبسط للبروتوكولات الأخرى التي تستخدم قوارير تحتوي على بئر مركزي ومغطاة بسدادات مطاطية14،15،16. على الرغم من أن دراسة المثال هنا يتم إجراؤها باستخدام زر…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل جزئيا من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 AR060456 (FL). نشكر الدكتور مايكل روبنسون وإليزابيث كريزمان (مستشفى الأطفال في فيلادلفيا) على مساعدتهما السخية في عداد التلألؤ.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
Referências
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
- Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).
- Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles. Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).
- Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart. Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).
- Cha, B. S., et al. Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).
- Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis. Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).
- Li, B., et al. Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation. FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).
- Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts. Cell Reports. 32 (10), 108108 (2020).
- Kim, S. P., et al. Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner. JCI Insight. 2 (16), 92704 (2017).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts. Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).
- Itoh, Y., et al. Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).
- Oba, M., Baldwin, R. L. 4. t. h., Bequette, B. J. Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels. Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
- Abdelmagid, S. A., et al. Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults. PLoS One. 10 (2), 0116195 (2015).
