Évaluation de l’oxydation du substrat énergétique in vitro avec piégeage de 14CO2
Summary
Ce protocole décrit une méthode facile à utiliser pour examiner l’oxydation du substrat en suivant la production de 14CO2 in vitro.
Abstract
Les mitochondries hébergent la machinerie du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et de la chaîne de transport d’électrons (ETC), qui génèrent de l’adénosine triphosphate (ATP) pour maintenir l’homéostasie énergétique. Le glucose, les acides gras et les acides aminés sont les principaux substrats énergétiques alimentant la respiration mitochondriale dans la plupart des cellules somatiques. Les preuves montrent que différents types de cellules peuvent avoir une préférence distincte pour certains substrats. Cependant, l’utilisation du substrat par diverses cellules du squelette n’a pas été étudiée en détail. De plus, comme le métabolisme cellulaire est adapté aux changements physiologiques et physiopathologiques, des évaluations directes de la dépendance au substrat dans les cellules squelettiques peuvent fournir des informations importantes sur la pathogenèse des maladies osseuses.
Le protocole suivant est basé sur le principe de la libération de dioxyde de carbone par les molécules de substrat après phosphorylation oxydative. En utilisant des substrats contenant des atomes de carbone marqués radioactivement (14C), la méthode fournit un test sensible et facile à utiliser pour le taux d’oxydation du substrat en culture cellulaire. Une étude de cas avec des préostéoblastes calvariaires primaires par rapport à des macrophages dérivés de la moelle osseuse (MGM) démontre une utilisation différente des principaux substrats entre les deux types de cellules.
Introduction
La phosphorylation oxydative (OXPHOS) chez les eucaryotes est le processus par lequel les nutriments sont décomposés à l’intérieur des mitochondries pour libérer de l’énergie chimique sous forme d’ATP par la consommation d’oxygène. Le catabolisme de divers substrats à l’intérieur des mitochondries par le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) génère directement peu de molécules d’ATP, mais stocke plutôt de l’énergie par réduction des transporteurs d’électrons nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et flavine adénine dinucléotide (FAD+). Les porteurs réduits sont ensuite oxydés par ETC situé sur la membrane interne des mitochondries pour générer un gradient de concentration de protons à travers la membrane. Les protons finissent par descendre leur gradient dans la matrice mitochondriale à travers l’ATP synthase pour produire de l’ATP. OXPHOS est le moyen le plus efficace de production d’ATP à partir de substrats énergétiques et généralement préféré dans les environnements aérobies. Auparavant, la glycolyse aérobie – la production de lactate à partir du glucose alors que l’oxygène est présent – était considérée comme physiopathologique, souvent une caractéristique des cellules cancéreuses. De plus en plus, on découvre que certains types de cellules normales utilisent la glycolyse aérobie pour des raisons qui n’ont pas encore été entièrement déchiffrées.
La flexibilité métabolique est la capacité des cellules ou des organismes à s’adapter à l’évolution des demandes d’énergie et des sources de carburant disponibles. Par exemple, la demande énergétique du muscle squelettique est principalement satisfaite par OXPHOS à l’état d’équilibre mais par la glycolyse anaérobie lors d’exercices de haute intensité1. À mesure que la durée de l’exercice augmente, l’oxydation du glucose et des acides gras contribue davantage à la production globale d’énergie2. Cependant, l’utilisation du substrat ne dépend pas seulement de la disponibilité, car les substrats rivalisent de manière antagoniste lors de l’oxydation. Plus particulièrement, il a été démontré que l’oxydation des acides gras inhibe l’utilisation du glucose par le muscle squelettique dans un phénomène connu sous le nom d’effet Randle3. Un effet réciproque a été démontré par des études ultérieures 4,5. En outre, de nombreuses maladies sont associées à un changement de préférence de substrat et au développement d’une rigidité métabolique dans les cellules. Par exemple, l’oxydation des acides gras est réduite dans le muscle squelettique des patients diabétiques de type II par rapport aux sujets témoins normaux6. Les changements métaboliques dans les contextes de la maladie font l’objet d’une enquête intense car ils peuvent contribuer à la pathogenèse.
Le métabolisme énergétique dans les types de cellules squelettiques est relativement peu étudié, mais a attiré l’attention ces dernières années7. Des travaux antérieurs ont montré que la glycolyse aérobie est la voie énergétique dominante dans les ostéoblastes calvariaires, tandis que l’oxydation du glucose par le cycle TCA joue un rôle dans la formation d’ostéoclastes 8,9. D’autres ont fourni des preuves que les acides gras étaient une source d’énergie pour les ostéoblastes10. Il a également été démontré que le catabolisme de la glutamine favorise la différenciation des ostéoblastes par rapport aux progéniteurs11,12. Cependant, une compréhension globale de l’utilisation du substrat par divers types de cellules squelettiques fait encore défaut. En outre, les changements dans le métabolisme cellulaire au cours de la différenciation cellulaire ou en réponse à des signaux pathologiques devraient modifier l’utilisation du substrat de carburant. Décrit ci-dessous est un protocole facile à utiliser pour tester l’oxydation du substrat in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole fournit une méthode facile à utiliser pour déterminer le taux d’oxydation des principaux substrats énergétiques. C’est une alternative plus simple aux autres protocoles qui utilisent des flacons contenant un puits central et coiffés de bouchons en caoutchouc 14,15,16. Bien que l’exemple d’étude ici soit réalisé avec une culture cellulaire, la méthode peut être facilement adaptée pour les explante…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail a été soutenu en partie par la subvention R01 AR060456 (FL) des NIH. Nous remercions le Dr Michael Robinson et Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) pour leur généreuse aide avec le compteur de scintillation.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
Referências
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