Beurteilung der Energiesubstratoxidation in vitro mit 14CO2 Trapping
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine einfach anzuwendende Methode zur Untersuchung der Substratoxidation durch Verfolgung der 14CO 2 -Produktion in vitro.
Abstract
Mitochondrien beherbergen die Maschinerie für den Tricarbonsäurezyklus (TCA) und die Elektronentransportkette (ETC), die Adenosintriphosphat (ATP) erzeugen, um die Energiehomöostase aufrechtzuerhalten. Glukose, Fettsäuren und Aminosäuren sind die wichtigsten Energiesubstrate, die die mitochondriale Atmung in den meisten Körperzellen antreiben. Es gibt Hinweise darauf, dass verschiedene Zelltypen eine deutliche Präferenz für bestimmte Substrate haben können. Die Substratverwertung durch verschiedene Zellen im Skelett wurde jedoch nicht im Detail untersucht. Da der Zellstoffwechsel auf physiologische und pathophysiologische Veränderungen abgestimmt ist, können direkte Bewertungen der Substratabhängigkeit in Skelettzellen wichtige Erkenntnisse über die Pathogenese von Knochenerkrankungen liefern.
Das folgende Protokoll basiert auf dem Prinzip der Kohlendioxidfreisetzung aus Substratmolekülen nach oxidativer Phosphorylierung. Durch die Verwendung von Substraten, die radioaktiv markierte Kohlenstoffatome (14C) enthalten, bietet die Methode einen empfindlichen und einfach zu verwendenden Assay für die Rate der Substratoxidation in Zellkultur. Eine Fallstudie mit primären kalvarialen Präosteoblasten im Vergleich zu aus dem Knochenmark abgeleiteten Makrophagen (BMMs) zeigt eine unterschiedliche Nutzung der Hauptsubstrate zwischen den beiden Zelltypen.
Introduction
Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) in Eukaryoten ist der Prozess, bei dem Nährstoffe in Mitochondrien abgebaut werden, um chemische Energie in Form von ATP durch Sauerstoffverbrauch freizusetzen. Der Katabolismus verschiedener Substrate innerhalb der Mitochondrien durch den Tricarbonsäurezyklus (TCA) erzeugt nur wenige ATP-Moleküle direkt, sondern speichert Energie durch Reduktion der Elektronenträger Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) und Flavinadenindinukleotid (FAD+). Die reduzierten Träger werden dann durch ETC oxidiert, das sich auf der inneren Membran der Mitochondrien befindet, um einen Protonenkonzentrationsgradienten über die Membran zu erzeugen. Die Protonen fließen schließlich durch die ATP-Synthase in ihrem Gradienten zurück in die mitochondriale Matrix, um ATP zu erzeugen. OXPHOS ist das effizienteste Mittel zur ATP-Herstellung aus Energiesubstraten und wird im Allgemeinen in aeroben Umgebungen bevorzugt. Früher wurde angenommen, dass die aerobe Glykolyse – die Produktion von Laktat aus Glukose, während Sauerstoff vorhanden ist – pathophysiologisch ist, oft ein Kennzeichen von Krebszellen. Mehr und mehr wird entdeckt, dass einige normale Zelltypen die aerobe Glykolyse aus Gründen verwenden, die noch nicht vollständig entschlüsselt wurden.
Metabolische Flexibilität ist die Fähigkeit von Zellen oder Organismen, sich an veränderte Energiebedürfnisse und verfügbare Brennstoffquellen anzupassen. Zum Beispiel wird der energetische Bedarf der Skelettmuskulatur hauptsächlich durch OXPHOS im stationären Zustand, aber durch anaerobe Glykolyse während hochintensiver Übungen1 gedeckt. Wenn die Trainingsdauer zunimmt, tragen Glukose- und Fettsäureoxidation mehr zur Gesamtenergieproduktionbei 2. Der Substrateinsatz hängt jedoch nicht nur von der Verfügbarkeit ab, da Substrate während der Oxidation antagonistisch konkurrieren. Vor allem hat sich gezeigt, dass die Fettsäureoxidation die Glukoseverwertung durch die Skelettmuskulatur in einem Phänomen hemmt, das als Randle-Effekt3 bekannt ist. Eine Wechselwirkung wurde durch nachfolgende Studiengezeigt 4,5. Darüber hinaus sind viele Krankheiten mit einer Veränderung der Substratpräferenz und der Entwicklung einer metabolischen Inflexibilität in Zellen verbunden. Zum Beispiel ist die Fettsäureoxidation in der Skelettmuskulatur von Typ-II-Diabetikern im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen reduziert6. Die metabolischen Veränderungen in den Krankheitseinstellungen sind Gegenstand intensiver Untersuchungen, da sie zur Pathogenese beitragen können.
Der Energiestoffwechsel in Skelettzelltypen ist relativ wenig erforscht, hat aber in den letzten Jahren an Aufmerksamkeit gewonnen7. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die aerobe Glykolyse der dominante Energieweg in kalvarialen Osteoblasten ist, während die Glukoseoxidation durch den TCA-Zyklus eine Rolle bei der Osteoklastenbildung spielt 8,9. Andere haben Beweise für Fettsäuren als Energiequelle für Osteoblasten10 geliefert. Es wurde auch gezeigt, dass der Glutaminkatabolismus die Osteoblastendifferenzierung von den Vorläufernunterstützt 11,12. Ein umfassendes Verständnis der Substratnutzung durch verschiedene Skelettzelltypen fehlt jedoch noch. Darüber hinaus wird erwartet, dass Veränderungen im Zellstoffwechsel während der Zelldifferenzierung oder als Reaktion auf pathologische Signale die Nutzung des Brennstoffsubstrats verändern. Im Folgenden wird ein einfach zu bedienendes Protokoll zur Untersuchung der Substratoxidation in vitro beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll bietet eine einfach zu bedienende Methode zur Bestimmung der Oxidationsrate wichtiger Energiesubstrate. Es ist eine einfachere Alternative zu anderen Protokollen, die Kolben verwenden, die einen zentralen Brunnen enthalten und mit Gummistopfen14,15,16 verschlossen sind. Obwohl die Beispielstudie hier mit Zellkultur durchgeführt wird, kann die Methode leicht für Gewebeexplantationen oder Gewebehomogenate angepasst…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit wurde zum Teil durch den NIH-Zuschuss R01 AR060456 (FL) unterstützt. Wir danken Dr. Michael Robinson und Elizabeth Krizman (The Children’s Hospital of Philadelphia) für ihre großzügige Hilfe bei der Szintillationstheke.
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
Referências
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