Este protocolo descreve um método fácil de usar para examinar a oxidação do substrato rastreando a produção de 14CO2 in vitro.
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Artigo de método
Avaliação da oxidação do substrato de energia in vitro com 14armadilhas de CO2
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mitocôndrias hospedam o maquinário para o ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte de elétrons (ETC), que geram triptosfato de adenosina (ATP) para manter a homeostase energética. Glicose, ácidos graxos e aminoácidos são os principais substratos de energia que alimentam a respiração mitocondrial na maioria das células somáticas. Evidências mostram que diferentes tipos de células podem ter uma preferência distinta por certos substratos. No entanto, a utilização do substrato por várias células no esqueleto não foi estudada em detalhes. Além disso, como o metabolismo celular está sintonizado com alterações fisiológicas e fisiodicos, avaliações diretas da dependência de substratos em células esqueléticas podem fornecer insights importantes sobre a patogênese das doenças ósseas.
O protocolo a seguir baseia-se no princípio da liberação de dióxido de carbono de moléculas de substrato após a fosforilação oxidativa. Ao usar substratos contendo átomos de carbono radioativos rotulados (14C), o método fornece um ensaio sensível e fácil de usar para a taxa de oxidação de substrato na cultura celular. Um estudo de caso com preosteoblasts primários do calvário versus macrófagos derivados da medula óssea (MMC) demonstra diferente utilização dos principais substratos entre os dois tipos de células.
Introdução
A fosforilação oxidativa (OXPHOS) em eucariotes é o processo pelo qual os nutrientes são divididos dentro das mitocôndrias para liberar energia química na forma de ATP através do consumo de oxigênio. O catabolismo de vários substratos dentro das mitocôndrias através do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) gera poucas moléculas de ATP diretamente, mas armazena energia através da redução dos portadores de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e dinucleotídeo de adenina flavin (FAD+). Os portadores reduzidos são então oxidados por ETC localizados na membrana interna das mitocôndrias para gerar um gradiente de concentração de prótons através da m....
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Protocolo
O uso de materiais radioativos (RAM) requer aprovação prévia por um comitê de segurança designado em cada instituição. Os RAMs usados neste protocolo foram aprovados pela Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) na Universidade da Pensilvânia. O uso de animais requer aprovação prévia do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais (IACUC) na instituição de origem. O estudo seguinte foi aprovado pela IACUC no Hospital Infantil da Filadélfia.
1. Preparação de soluções de estoque para substratos rotulados em C
- Faça 4 mM de solução de estoque de soro bovino (BSA) misturando 11 g de BSA e 33,1 mL d....
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Resultados
Neste exemplo, o método de captura de CO2 é usado para comparar a oxidação do substrato por preosteoblasts pré-sísceros do calvário primário versus BMMs, que são frequentemente usados para a diferenciação de osteoblasto in vitro ou osteoclasta, respectivamente. Depois que as células primárias são passaged e cultivadas em cMEMα durante a noite, elas normalmente atingem 80-90% de confluência e exibem sua morfologia característica. Os preosteoblastas calvariais são notavelmente maiores que os BMMs (
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Discussão
O protocolo fornece um método fácil de usar para determinar a taxa de oxidação dos principais substratos de energia. É uma alternativa mais simples a outros protocolos que usam frascos contendo um poço central e tampados com rolhas de borracha 14,15,16. Embora o exemplo de estudo aqui seja realizado com cultura celular, o método pode ser facilmente adaptado para explantos teciduais ou homogeneizadores de tecidos contendo mitocôn.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Agradecimentos
O trabalho foi apoiado em parte pela concessão do NIH R01 AR060456 (FL). Agradecemos ao Dr. Michael Robinson e Elizabeth Krizman (Hospital Infantil da Filadélfia) por sua generosa ajuda com o contador de cintilação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m filtros | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Usado para filtrar a solução BSA |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociar células de placas de cultura de células Tubos |
| Eppendorf de 1,5 mL | PR1MA | PR MCT17 RB | Usado para incubação de reação |
| Placas de 10 cm | TPP | 93100 | Usado para cultura de células |
| Seringa de 10 mL | BD | 302995 | Usado para lavar a medula de ossos longos |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | Para preparação de meio de cultura de células |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Usado para fazer meios |
| quentes14C-glutamina | PerkinElmer | NEC451050UC | Usado para fazer meios |
| quentes14C-oleato | PerkinElmer | NEC317050UC | Usado para fazer mídia quente |
| Agulha de 23 G | BD | 305120 | Usado para lavar medula de ossos longos |
| Placas de 24 poços | TPP | 92024 | Usado para cultura de células |
| 70 μ filtros de células m | MIDSCI | 70CELL | Usado para filtrar o sobrenadante durante a digestão cavarial |
| Corante Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Cora células vivas para determinar a densidade da semente Soro |
| bovino Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Usado para conjugação de ácidos graxos |
| Celômetro Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determinar o número de células viáveis | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Usado para pellet células |
| Colagenase tipo II | Worthington | LS004176 | Dissociar células do tecido |
| MEM alfa personalizado | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Usado para criar meios quentes personalizados |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Usado para dissolver e diluir reagentes, e lavar pratos de cultura |
| Papel de Filtro | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Armadilhas CO2 com hidróxido de sódio |
| Glicose | Sigma-Aldrich | g7528 | Usado para fazer meios personalizados |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Armadilhas CO2 durante a cultura de células |
| L-carnitina | Sigma-Aldrich | C0283 | Suplementado para oxidação de ácidos graxos |
| L-Glutamina | Sigma-Aldrich | g3126 | Usado para fazer meios personalizados |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Meio de cultura celular |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Usado para selar placas de cultura |
| de células Penicilina-estreptomicina | Thermo Fisher | 15140122 | Previne a contaminação em cultura de células |
| Ácido Perclórico | Sigma-Aldrich | 244252 | Libera CO2 durante o ensaio metabólico |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Usado para fazer meios personalizados |
| Contador de Cintilação | Beckman Coulter | LS6500 | Determina a radioatividade do papel de filtro |
| Fluido de Cintilação | MP Biomedicals | 882453 | Absorva a energia emitida pelas RAMs e reemite-a como flashes de luz |
| Frasco de cintilação Fisher | Scientific | 03-337-1 | Recipientes de reação para fluido de cintilação |
| Carbonato de sódio | Sigma-Aldrich | S5761 | Tampão de equilíbrio para meio |
| Hidróxido de sódio | Sigma-Aldrich | 58045 | Retém CO2 durante o ensaio de metaboilização |
| Oleato | de sódioSANTA CRUZ | SC-215879 | BSA preparação de ácidos graxos conjugados |
| Filtração a vácuo 1000 | TPP | 99950 | Filtro cMEMα |
Referências
- Hargreaves, M., Spriet, L. L. Skeletal muscle energy metabolism during exercise. Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).
- Jeukendrup, A. E. Regulation of fat metabolism in skeletal muscle. Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).
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Reimpressões e permissões
