14CO2トラップによるインビトロでのエネルギー基板酸化の評価
Summary
このプロトコルは、インビトロで14CO2産生を追跡することによって基板酸化を調べるための使いやすい方法を記載している。
Abstract
ミトコンドリアは、エネルギー恒常性を維持するためにアデノシン三リン酸(ATP)を生成するトリカルボン酸(TCA)サイクルと電子輸送鎖(ETC)の機構をホストします。グルコース、脂肪酸、およびアミノ酸は、ほとんどの体細胞においてミトコンドリア呼吸を促進する主要なエネルギー基質である。証拠は、異なる細胞型が特定の基質に対して明確な選好を有し得ることを示している。しかしながら、骨格中の各種細胞による基質利用は詳細に検討されていない。さらに、細胞代謝は生理学的および病態生理学的変化に順応しているため、骨格細胞における基質依存性の直接評価は、骨疾患の病因に関する重要な洞察を提供する可能性がある。
以下のプロトコールは、酸化的リン酸化に続く基質分子からの二酸化炭素放出の原理に基づいている。放射性標識された炭素原子(14C)を含む基質を使用することにより、この方法は、細胞培養における基質酸化速度について、高感度で使いやすいアッセイを提供する。原発性頭蓋骨前骨芽細胞と骨髄由来マクロファージ(BMM)とのケーススタディは、2つの細胞型間で主要な基質の利用率が異なることを示しています。
Introduction
真核生物における酸化的リン酸化(OXPHOS)は、栄養素がミトコンドリア内で分解され、酸素の消費を通じてATPの形で化学エネルギーを放出するプロセスである。 トリカルボン酸(TCA)サイクルを介したミトコンドリア内部の様々な基質の異化作用は、少数のATP分子を直接生成するが、むしろ電子伝達体ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびフラビンアデニンジヌクレオチド(FAD+)の還元によってエネルギーを貯蔵する。次いで、還元された担体は、ミトコンドリアの内膜に位置するETCによって酸化され、膜を横切ってプロトン濃度勾配を生成する。プロトンは最終的にATP合成酵素を介してミトコンドリアマトリックスに勾配を流れ込み、ATPを生成する。OXPHOSは、エネルギー基質からのATP生産の最も効率的な手段であり、好気性環境で一般的に好ましい。以前は、好気性解糖系 – 酸素が存在する間にグルコースから乳酸を生成する – は病態生理学的であると考えられており、しばしば癌細胞の特徴である。いくつかの正常な細胞型が、まだ完全に解読されていない理由で好気性解糖系を使用することがますます発見されています。
代謝の柔軟性は、細胞または生物が変化するエネルギー需要および利用可能な燃料源に適応する能力である。例えば、骨格筋のエネルギー需要は、主に定常状態ではOXPHOSによって満たされるが、高強度運動中の嫌気性解糖系によって満たされる1。運動時間が長くなるにつれて、グルコースと脂肪酸の酸化は全体的なエネルギー生産に大きく寄与します2。しかしながら、基質の使用は、基質が酸化中に拮抗的に競合するため、入手可能性にのみ依存するものではない。最も顕著なのは、脂肪酸酸化が、ランドル効果3として知られる現象において骨格筋によるグルコース利用を阻害することが示されている。相反効果は、その後の研究4、5によって実証された。さらに、多くの疾患は、基質嗜好の変化および細胞における代謝不柔軟性の発症と関連している。例えば、脂肪酸酸化は、正常対照被験者6と比較してII型糖尿病患者の骨格筋において減少している。疾患設定における代謝変化は、病因に寄与する可能性があるため、激しい調査の対象となっている。
骨格細胞型におけるエネルギー代謝は比較的研究されていないが、近年注目されている7。これまでの研究は、好気性解糖系が歯蓋骨芽細胞における支配的なエネルギー経路であり、TCAサイクルを介したグルコース酸化が破骨細胞形成において役割を果たすことを示している8,9。その他は、骨芽細胞のエネルギー源としての脂肪酸の証拠を提供している10。グルタミン異化作用はまた、前駆細胞11、12からの骨芽細胞分化を支持することが示されている。しかしながら、様々な骨格細胞型による基質利用の包括的な理解は、依然として欠けている。さらに、細胞分化中または病理学的シグナルに応答した細胞代謝の変化は、燃料基質の利用率を変化させると予想される。以下に説明するのは、インビトロで基質酸化をアッセイするための使いやすいプロトコールです。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、主要なエネルギー基板の酸化速度を決定するための使いやすい方法を提供します。これは、中央ウェルを含むフラスコを使用し、ゴム栓14、15、16で蓋をする他のプロトコルに代わるより簡単な代替手段である。ここでの実施例研究は細胞培養を用いて行われるが、この方法は、先に説明したように、無…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01 AR060456(FL)によって部分的に支援されました。マイケル・ロビンソン博士とエリザベス・クリズマン博士(フィラデルフィア小児病院)がシンチレーションカウンターを惜しみなく助けてくれたことに感謝します。
Materials
| 0.22 µm filters | Sigma-Aldrich | SLGVM33RS | Used to filter BSA solution |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Dissociate cells from cell culture plates |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | PR1MA | PR MCT17 RB | Used for reaction incubation |
| 10 cm plates | TPP | 93100 | Used for cell culture |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | Used to flush marrow from long bones |
| 10% FBS | Atlanta biologicals | S11550 | For Cell culture medium preparation |
| 14C-Glucose | PerkinElmer | NEC042X050UC | Used to make hot media |
| 14C-glutamine | PerkinElmer | NEC451050UC | Used to make hot media |
| 14C-oleate | PerkinElmer | NEC317050UC | Used to make hot media |
| 23 G needle | BD | 305120 | Used to flush marrow from long bones |
| 24-well plates | TPP | 92024 | Used for cell culture |
| 70 μm cell strainers | MIDSCI | 70CELL | Used to filter supernatant during cavarial digestion |
| Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) dye | Nexcelom Biosciences | CS2-0106 | Stains live cells to determine seed density |
| Bovine Serum Ablumin | Proliant Biologicals | 68700 | Used for fatty acid conjugation |
| Cellometer Auto 2000 | Nexcelom Biosciences | Determine the number of viable cells | |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Legend Micro 21R | Used to pellet cells |
| Collagenase type II | Worthington | LS004176 | Dissociate cells from tissue |
| Custom MEM alpha | GIBCO | SKU: ME 18459P1 | Used to create custom hot media |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | Used to dissolve and dilute reagents, and wash culture dishes |
| Filter Paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | Traps CO2 with sodium hydroxide |
| Glucose | Sigma-Aldrich | g7528 | Used to make custom media |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Traps CO2 during cell culture |
| L-carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | Supplemented for fatty acid oxidation |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | g3126 | Used to make custom media |
| MEM alpha | Thermo | A10490 | Cell culture medium |
| Parafilm | Pecheney Plastic Packaging | PM998 | Used to seal cell culture dishes |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | Prevents contamination in cell culture |
| Perchloric Acid | Sigma-Aldrich | 244252 | Releases CO2 during metabolic assay |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | p5280 | Used to make custom media |
| Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | Determines radioactivity from the filter paper |
| Scintillation Fluid | MP Biomedicals | 882453 | Absorb the energy emitted by RAMs and re-emit it as flashes of light |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-337-1 | Reaction containers for scintillation fluid |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Balance buffer for medium |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 58045 | Traps CO2 during metaboilc assay |
| Sodium oleate | SANTA CRUZ | SC-215879 | BSA conjugated fatty acid preparation |
| Vaccum filtration 1000 | TPP | 99950 | Filter cMEMα |
Referências
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