本方案演示了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜所涉及的不同步骤。再生或完全恢复的角膜可以在伤口手术后使用各种细胞和分子技术分析再生潜力。
雏鸡胚胎角膜伤口表现出完全和快速再生的显着能力,而成年受伤的角膜由于纤维化瘢痕形成而失去透明度。受伤胚胎角膜的组织完整性内在恢复,没有可检测到的疤痕形成。鉴于其可及性和易于操作性,雏鸡胚胎是研究无疤痕角膜伤口修复的理想模型。该协议展示了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜所涉及的不同步骤。首先,卵子在胚胎早期年龄开窗以进入眼睛。其次,对胚胎外膜进行一系列 卵内 物理操作,以确保在发育的后期阶段保持对眼睛的访问,对应于角膜的三个细胞层形成的时间。第三,穿透外上皮层和前基质的线性角膜伤口是使用显微外科刀制成的。在伤口手术之后,可以使用各种细胞和分子技术分析再生过程或完全恢复的角膜的再生潜力。迄今为止使用该模型的研究表明,受伤的胚胎角膜显示角质形成细胞分化的激活,ECM蛋白协调重塑为其天然的三维宏观结构,并被角膜感觉神经充分重新支配。将来,内源性或外源性因素对再生过程的潜在影响可以通过使用发育生物学技术(例如组织移植,电穿孔,逆转录病毒感染或珠子植入)来分析角膜愈合。目前的策略将胚胎雏鸡确定为阐明协调无疤痕角膜伤口愈合的分子和细胞因子的关键实验范例。
角膜是眼睛最外层的透明组织,透射和折射有利于视力的光。在成人角膜中,角膜基质的损伤或感染导致快速而强大的伤口愈合反应,其特征在于角质形成细胞增殖,纤维化,导致细胞因子诱导的细胞凋亡的炎症增加,修复肌成纤维细胞的产生以及细胞外基质(ECM)的整体重塑1,2.损伤后,这种角膜组织修复导致不透明的疤痕组织,降低角膜透明度并阻塞光线通过,从而扭曲视力,在最严重的情况下,导致角膜失明3。因此,显然需要开发可靠的动物模型来解决伤口愈合的复杂性,并确定负责伤口闭合和组织再生的细胞和分子因素。
迄今为止,大多数检查角膜伤口愈合的研究都使用了产后4 或成年动物模型1,2,5,6,7。虽然这些研究在理解角膜伤口愈合反应和疤痕形成机制方面取得了重大进展,但这些愈合模型中受损的角膜组织未能完全再生,从而限制了它们识别负责完全概括损伤后角膜形态和结构的分子因素和细胞机制的实用性。相比之下,用刀在胚胎雏鸡角膜中产生的胎儿伤口具有以无疤痕的方式完全愈合的内在能力8。具体而言,胚胎雏鸡角膜表现出非纤维再生,细胞外基质结构和神经支配模式8,9的完全概括。
本方案描述了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜的一系列步骤。首先,卵子在胚胎早期年龄开窗,以促进胚胎的进入。其次,对胚胎外膜进行一系列 卵内 物理操作,以确保在发育的后期阶段保持对眼睛的访问,对应于角膜的三个细胞层形成并且需要伤口的时间。第三,使用显微外科刀制作穿透角膜上皮并进入前基质的线性中央角膜切口。在伤口手术之后,可以使用各种细胞和分子技术分析再生过程或完全恢复的角膜的再生潜力。
雏鸡是研究胎儿无疤痕角膜伤口修复的理想模型系统。与哺乳动物不同,在整个发育过程中,使用 卵8或 前卵 策略24很容易获得雏鸡。胚胎雏鸡角膜比啮齿动物角膜大得多,近50%的颅骨体积专用于眼睛25,使其非常适合物理操作,例如受伤。此外,鸡蛋全年都很容易买到,通常来自当地农场,而且具有成本效益,只需要一个温水?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了伊利诺伊卫斯理大学向TS提供的艺术和学术发展补助金的支持,部分资金来自NIH-R01EY022158(PL)。
18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
Chicken egg trays | GQF | O246 | |
Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |