배아 상처 병아리 각막의 흉터없는 조직 재생 조사
Summary
본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 다른 단계를 보여줍니다. 재생 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있습니다.
Abstract
병아리 배아 각막 상처는 완전하고 신속하게 재생하는 놀라운 능력을 나타내는 반면, 성인 상처 각막은 섬유성 흉터로 인해 투명성 상실을 경험합니다. 손상된 배아 각막의 조직 무결성은 검출 가능한 흉터 형성없이 본질적으로 회복됩니다. 접근성과 조작의 용이성을 감안할 때, 병아리 배아는 흉터가없는 각막 상처 복구를 연구하기위한 이상적인 모델입니다. 이 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 것과 관련된 여러 단계를 보여줍니다. 첫째, 계란은 초기 배아 나이에 눈에 접근하기 위해 창문을 만듭니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되는 경우에 해당하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록 보장하기 위해 일련의 난 소 내 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 외부 상피층과 전방 스트로마를 관통하는 선형 각막 상처는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다. 이 모델을 사용한 지금까지의 연구에 따르면 상처 입은 배아 각막은 각질세포 분화의 활성화를 나타내며, ECM 단백질을 본래의 입체 거대 구조로 조율 리모델링하고, 각막 감각 신경에 의해 적절하게 재 신경을 과민 반응시키는 것으로 나타났습니다. 미래에는 재생 과정에 대한 내인성 또는 외인성 요인의 잠재적 인 영향을 조직 이식, 전기 천공, 레트로 바이러스 감염 또는 비드 이식과 같은 발달 생물학 기술을 사용하여 각막 치유에서 분석 할 수 있습니다. 현재의 전략은 배아 병아리를 흉터가없는 각막 상처 치유를 조정하는 분자 및 세포 인자를 해명하기위한 중요한 실험 패러다임으로 식별합니다.
Introduction
각막은 시력에 도움이되는 빛을 전달하고 굴절시키는 눈의 투명하고 가장 바깥 쪽 조직입니다. 성인 각막에서, 각막 기질에 대한 손상 또는 감염은 각질세포 증식, 섬유증, 사이토카인-유도된 아폽토시스로 이어지는 염증 증가, 수복 근섬유아세포의 생성, 및 세포외 기질(ECM)의 전반적인 리모델링을 특징으로 하는 신속하고 강력한 상처 치유 반응을 유도한다1,2 . 손상 후, 이러한 각막 조직 복구는 각막 투명성을 감소시키고 빛의 통과를 방해하는 불투명 한 흉터 조직을 초래하여 시력을 왜곡시키고 가장 심한 경우에는 각막 실명으로 이어진다3. 따라서, 상처 치유의 복잡성을 해결하고 상처 폐쇄 및 조직 재생을 담당하는 세포 및 분자 인자를 확인하기 위해 신뢰할 수 있는 동물 모델을 개발할 필요가 분명히 있다.
현재까지 각 막 상처 치유를 조사하는 대부분의 연구는 출생 후4 또는 성인 동물 모델1,2,5,6,7을 활용했습니다. 이러한 연구들이 각막 상처 치유 반응과 흉터 형성의 근간이 되는 메커니즘에 대한 이해에 상당한 발전을 가져왔지만, 이러한 치유 모델에서 손상된 각막 조직은 완전히 재생되지 못하고, 따라서 각막 형태학 및 손상 후 구조를 완전히 되풀이하는 분자 인자 및 세포 메커니즘을 확인하는 데 그 유용성을 제한한다. 대조적으로, 배아 병아리 각막에서 칼로 생성된 태아 상처는 흉터가 없는 방식으로 완전히 치유될 수 있는 내재적 능력을 가지고 있다8. 구체적으로, 배아 병아리 각막은 세포외 기질 구조 및 신경 과민 패턴 8,9의 완전한 재회고와 함께 비섬유성 재생을 나타낸다.
본 프로토콜은 오보에서 배아 병아리의 각막을 상처 입히는 데 관련된 일련의 단계를 기술한다. 첫째, 난자는 배아에 쉽게 접근 할 수 있도록 초기 배아 시대에 창문이 있습니다. 둘째, 각막의 세 세포층이 형성되고 상처가 필요할 때 상응하는 발달의 후기 단계를 통해 눈에 대한 접근이 유지되도록하기 위해 배아 외 막에 대한 일련의 물리적 조작이 수행됩니다. 셋째, 각막 상피를 관통하고 전방 스트로마로 침투하는 선형 중앙 각막 절개는 미세 외과 용 나이프를 사용하여 만들어집니다. 재생 과정 또는 완전히 회복된 각막은 상처 절차에 따라 다양한 세포 및 분자 기술을 사용하여 재생 전위를 분석할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
병아리는 태아, 흉터가없는 각막 상처 수리를 연구하기위한 이상적인 모델 시스템입니다. 포유동물과는 달리, 병아리는 ovo 8 또는 ex ovo 전략(24)을 사용하여 개발 전반에 걸쳐 쉽게 접근할 수 있다. 배아 병아리 각막은 설치류 각막보다 훨씬 크며, 두개골 부피의 거의 50 %가 눈25에 전념하여 상처와 같은 신체적 조작에 매우 적합합?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일리노이 웨슬리안 대학을 통해 TS에 예술 및 학술 개발 보조금에 의해 지원되었으며 NIH-R01EY022158 (PL)이 부분적으로 자금을 지원했습니다.
Materials
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
Referências
- Wilson, S. E. Corneal wound healing. Experimental Eye Research. 197, 108089 (2020).
- Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
- Whitcher, J. P., Srinivasan, M., Upadhyay, M. P. Corneal blindness: a global perspective. Bulletin of the World Health Organization. 79 (3), 214-221 (2001).
- Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2001).
- Berdahl, J. P., Johnson, C. S., Proia, A. D., Grinstaff, M. W., Kim, T. Comparison of sutures and dendritic polymer adhesives for corneal laceration repair in an in vivo chicken model. Archives of Ophthalmology. 127 (4), 442-447 (2009).
- Fowler, W. C., Chang, D. H., Roberts, B. C., Zarovnaya, E. L., Proia, A. D. A new paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken (Gallus gallus domesticus). Current Eye Research. 28 (4), 241-250 (2004).
- Huh, M. I., Kim, Y. E., Park, J. H. The distribution of TGF-β isoforms and signaling intermediates in corneal fibrotic wound repair. Journal of Cellular Biochemistry. 108 (2), 476-488 (2009).
- Spurlin, J. W., Lwigale, P. Y. Wounded embryonic corneas exhibit nonfibrotic regeneration and complete innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (9), 6334-6344 (2013).
- Koudouna, E., Spurlin, J., Babushkina, A., Quantock, A. J., Jester, J. V., Lwigale, P. Y. Recapitulation of normal collagen architecture in embryonic wounded corneas. Scientific Reports. 10 (1), 13815 (2020).
- Luo, J., Redies, C. Ex ovo electroporation for gene transfer into older chicken embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1470-1477 (2005).
- Spurlin, J., Lwigale, P. Y. A technique to increase accessibility to late-stage chick embryos for in ovo manipulations. Developmental Dynamics. 242 (2), 148-154 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Neath, P., Roche, S. M., Bee, J. A. Intraocular pressure dependent and independent growth phases of the embryonic chick eye and cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (9), 2483-2491 (1991).
- Matsuda, A., Yoshiki, A., Tagawa, Y., Matsuda, H., Kusakabe, M. Corneal wound healing in tenascin knockout mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (6), 1071-1080 (1990).
- Nishida, T., Nakagawa, S., Nishibayashi, C., Tanaka, H., Manabe, R. Fibronectin enhancement of corneal epithelial wound healing of rabbits in vivo. Archives of Ophthalmology. 102 (3), 455-456 (1984).
- Sumioka, T., et al. Impaired cornea wound healing in a tenascin C-deficient mouse model. Lab Investigation. 93 (2), 207-217 (2013).
- Tervo, K., van Setten, G. B., Beuerman, R. W., Virtanen, I., Tarkkanen, A., Tervo, T. Expression of tenascin and cellular fibronectin in the rabbit cornea after anterior keratectomy. Immunohistochemical study of wound healing dynamics. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 32 (11), 2912-2918 (1991).
- Lwigale, P. Y., Bronner-Fraser, M. Lens-derived Semaphorin3A regulates sensory innervation of the cornea. Biologia do Desenvolvimento. 306 (2), 750-759 (2007).
- Kubilus, J. K., Linsenmayer, T. F. Developmental corneal innervation: interactions between nerves and specialized apical corneal epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (2), 782-789 (2010).
- Schwend, T., Deaton, R. J., Zhang, Y., Caterson, B., Conrad, G. W. Corneal sulfated glycosaminoglycans and their effects on trigeminal nerve growth cone behavior in vitro: roles for ECM in cornea innervation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (13), 8118-8137 (2012).
- Lee, M. K., Tuttle, J. B., Rebhun, L. I., Cleveland, D. W., Frankfurter, A. The expression and posttranslational modification of a neuron-specific beta-tubulin isotype during chick embryogenesis. Cell Motility and the Cytoskeleton. 17 (2), 118-132 (1990).
- Chen, X., Nadiarynkh, O., Plotnikov, S., Campagnola, P. J. Second harmonic generation microscopy for quantitative analysis of collagen fibrillar structure. Nature Protocols. 7, 654-669 (2012).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Waldvogel, J. A. The bird’s eye view. American Scientist. 78, 342-353 (1990).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131 (13), 3021-3034 (2004).
- Wilson, S. E., Mohan, R. R., Mohan, R. R., Ambrosio, R., Hong, J., Lee, J. The corneal wound healing response: cytokine-mediated interaction of the epithelium, stroma, and inflammatory cells. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (5), 625-637 (2001).
