포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제
Summary
프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.
Abstract
유비퀴틴화는 기질 단백질의 안정성뿐만 아니라 국소화 및 기능을 조절하는 번역 후 변형의 한 유형입니다. 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 거의 모든 기본적인 세포 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 기질 단백질의 기능을 제어하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 조사를 돕습니다. 여기서, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 단계별 절차가 p53 종양 억제 단백질을 예로 들어 설명된다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 정제하였다. 총 세포 플래그-태그된 p53 단백질을 비변성 조건 하에 항-플래그 항체-접합된 아가로스로 정제하였다. 대안적으로, 총 세포 His-태그된 유비퀴틴화 단백질을 변성 조건 하에 니켈-하전된 수지를 사용하여 정제하였다. 용출액에서 유비퀴틴화된 p53 단백질은 특정 항체로 성공적으로 검출되었습니다. 이 절차를 사용하여 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게합니다.
Introduction
유비퀴틴은 76 개의 아미노산 1,2,3의 진화 적으로 보존 된 단백질입니다. 유비퀴틴은 활성화 (E1), 접합 (E2) 및 리가 아제 (E3) 효소를 포함하는 캐스케이드를 통해 표적 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합합니다. 유비퀴틴은 먼저 E1 효소에 의해 활성화 된 다음 E2 접합 효소로 옮겨집니다. 이어서, E3 유비퀴틴 리가 아제는 유비퀴틴-로딩 된 E2 효소 및 기질 단백질 모두와 상호 작용하고, 유비퀴틴의 C- 말단과 기질 1,2,3,4,5의 라이신 잔기 사이의 이소 펩티드 결합의 형성을 매개한다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 잔기를 기질 단백질 상의 라이신 잔기 또는 그 자체에 부착시켜 단백질 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다. 이 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴-프로테 아좀 시스템 1,2,3,4,5를 통해 기질 단백질의 분해를 초래한다. 또한, 유비퀴틴화는 세포3,5에서 단백질 세포 내 국소화, 단백질 복합체 형성 및 단백질 트래피킹을 조절한다. 기질 단백질에 연결된 유비퀴틴 잔기는 데유비퀴틴화 효소(DUB)에 의해 제거될 수 있습니다6,7. 특히, 유비퀴틴 사슬이 조립되는 다양한 방법은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 무수한 수단을 제공합니다 1,5. 기질 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 정확한 역할은 지금까지 불완전하게 이해되고 있습니다. 유비퀴틴화 된 단백질의 정제는 다양한 세포 과정에 대한 단백질 유비퀴틴화의 효과의 해명에 기여한다.
p53 단백질은 가장 중요한 종양 억제 단백질 중 하나이며 거의 모든 인간 암 8,9,10,11에서 유전 적 돌연변이 또는 불 활성화를 나타냅니다. p53 안정성 및 활성은 유비퀴틴화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화12,13을 포함하는 번역후 변형에 의해 생체내에서 섬세하게 조절된다. p53 단백질은 다양한 세포에서 6 분에서 40 분 범위의 짧은 반감기를 가지며, 이는 주로 폴리 유비 퀴틴 화 및 후속 프로테아좀 분해10,12로 인해 발생합니다. 마우스 더블분 2 (Mdm2)는 p53의 N 말단에 결합하여 그의 전사 활성12,14,15를 억제하는 p53의 E3 유비퀴틴 리가제이다. Mdm2는 p53의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진하여 안정성을 제어하고 p53의 모노유비퀴틴화를 유도하여 핵 수출12,14,15,16을 촉진합니다. 여기서, 유비퀴틴화 Mdm2 매개 p53은 포유동물 세포로부터 유비퀴틴화 단백질을 정제하는 방법을 구체적으로 소개하기 위한 예로 사용된다. 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태에 영향을 미치는 조절자는 포유류 세포에서 과발현되거나 녹다운/녹아웃될 때 이 생체 내 유비퀴틴화 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한, 유비퀴틴화 단백질은 시험관내 탈유비퀴틴화 분석을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질을 개별 DUB와 함께 배양하여 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 세포에서 다운스트림 신호전달 단백질을 모집하는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 유비퀴틴화된 표적 단백질 복합체는 천연 정제 조건 하에서 순차적 면역침전에 의해 정제될 수 있고 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 현재 프로토콜은 유비퀴틴화에 의해 조절되는 세포 단백질을 조사하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.
친화성 태그가 부착된 유비퀴틴, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 유비퀴틴 결합 도메인(UBD)의 사용을 포함하는 유비퀴틴화된 단백질을 정제하기 위한 몇 가지 방법이 확립되었습니다17. 여기에서는 포유동물 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 매개체로 친화성 태그된 유비퀴틴을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 다른 방법들에 비해 이점을 제공한다. 유비퀴틴화 단백질은 강력한 변성제의 존재 하에서 정제되며, 이는 세포 단백질을 선형화하고 단백질-단백질 상호 작용을 방해함으로써 니켈 하전 수지에 대한 비특이적 결합을 감소시킵니다. 대조적으로, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 UBD를 매개체로 사용하는 것은 덜 엄격한 조건에서 정제를 수행해야 하기 때문에 표적 단백질에서 결합 파트너를 효과적으로 배제할 수 없습니다. 더욱이, 정제는 또한 이들 매개체를 사용하여 관련없는 단백질의 결합 증가를 유도 할 수있다. 또한, 다양한 유비퀴틴 결합 유형뿐만 아니라 유비퀴틴 결합 단백질 또는 단리된 UBDs(17)에 의한 모노- 및 폴리-유비퀴틴화에 대한 결합 성향이 존재한다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 모든 세포 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리는 데 기여합니다. 대안적으로, 시판되는 항-플래그 또는 항-HA 항체-접합된 아가로스의 사용은 비변성 조건 하에서 대규모 플래그- 또는 HA-태그된 표적 단백질을 면역침전시키는 것을 용이하게 한다. 제2 정제 단계는, 예를 들어, 폴리-히스-태그된 유비퀴틴을 표적화하는 니켈-하전된 수지에 의해, 다운스트림 실험을 위해 고순도의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 획득하는데 사용될 수 있다. 특히, 에피토프 태깅 정제 전략은 표적 단백질을 효과적으로 면역침전시키기 위해 특정 항체를 획득할 수 없을 때 적응될 수 있다. 마지막으로, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질의 정제는 시험관 내 정제와 비교하여 더 많은 생리학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
유비퀴틴화는 거의 모든 생리적 및 병리학적 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다2. 최근 몇 년 동안 신호 전달 경로에서 유비퀴틴의 분자 역할과 유비퀴틴 시스템의 변화가 어떻게 다른인간 질병을 유발하는지 이해하는 데 큰 진전이 있었습니다2. 유비퀴틴화 단백질의 정제는 이러한 공정에서 유비퀴틴화의 정확한 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 기여합니…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81972624)의 DL 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
Referências
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