Un modello murino eterotopico per lo studio del trapianto laringeo
Summary
Lo scopo di questo manoscritto è quello di descrivere le fasi microchirurgiche necessarie per eseguire un trapianto laringeo eterotopico nei topi. I vantaggi di questo modello murino rispetto ad altri modelli animali di trapianto laringeo sono il suo rapporto costo-efficacia e la disponibilità di saggi e dati immunologici.
Abstract
Il trapianto eterotopico laringeo, sebbene sia una procedura tecnicamente impegnativa, offre maggiori analisi scientifiche e benefici in termini di costi rispetto ad altri modelli animali. Sebbene descritta per la prima volta da Shipchandler et al. nel 2009, questa tecnica non è ampiamente utilizzata, probabilmente a causa delle difficoltà nell’apprendimento della tecnica microchirurgica e del tempo necessario per padroneggiarla. Questo documento descrive in dettaglio i passaggi chirurgici, nonché le potenziali insidie da evitare, al fine di incoraggiare un uso efficace di questa tecnica.
In questo modello, le arterie carotidi bilaterali della laringe donatrice sono anastomizzate, all’arteria carotide ricevente e alla vena giugulare esterna, consentendo il flusso sanguigno attraverso l’innesto. Il flusso sanguigno può essere confermato intraoperatoriamente dalla visualizzazione del riempimento del sangue nelle arterie carotidi bilaterali dell’innesto, dall’arrossamento delle ghiandole tiroidee dell’innesto e dal sanguinamento dai micro vasi nell’innesto. Gli elementi cruciali per il successo includono la delicata conservazione dei vasi dell’innesto, l’arteriotomia e la venotomia delle dimensioni corrette e l’utilizzo del numero appropriato di punti di sutura sulle anastomosi arterioso-arteriose e arterioso-venose per fissare i vasi senza perdite e prevenire l’occlusione.
Chiunque può diventare esperto in questo modello con una formazione sufficiente ed eseguire la procedura in circa 3 ore. Se eseguito con successo, questo modello consente di eseguire studi immunologici con facilità e a basso costo.
Introduction
Per i pazienti affetti da danni irreparabili alla laringe o cancro della laringe, una laringectomia totale è spesso l’unica opzione1. La laringectomia totale lascia i pazienti senza la capacità di respirare e parlare da soli, oltre a sperimentare disagio sociale e psicologico2. I pazienti con cancro della laringe che necessitano di una laringectomia totale sono eccellenti potenziali candidati per il trapianto laringeo. Mentre è stato eseguito il trapianto laringeo umano nel contesto di danni laringei irreparabili, l’allotrapianto della laringe è attualmente evitato in questi pazienti a causa del timore di recidiva del tumore, della possibilità di rigetto cronico e delle infezioni derivate dal donatore3. L’immunosoppressione è la causa principale di queste preoccupazioni. La drammatica perdita del primo paziente con trapianto parziale di laringe a causa della recidiva del tumore dopo trattamento immunosoppressivo convenzionale è la prova che un regime immunosoppressivo appropriato dovrebbe essere messo a punto prima di ulteriori tentativi di trapianto nei pazienti con cancro della laringe 4,5.
Per comprendere meglio la risposta immunitaria dell’ospite a una laringe trapiantata, il primo modello di trapianto laringeo nei ratti è stato sviluppato nel 1992 da Strome, e miglioramenti alla tecnica chirurgica sono stati apportati nel 2002 6,7. Sebbene questo modello sia efficace per lo studio del trapianto laringeo, la mancanza di agenti immunologici specifici per il ratto e il costo più elevato associato ai modelli di ratto hanno portato allo sviluppo di un nuovo modello murino per lo studio del trapianto laringeo nel 20098.
L’applicazione principale della tecnica descritta è studiare diversi regimi farmacologici immunosoppressori nel trapianto laringeo. Il miglioramento delle attuali terapie immunosoppressive può ampliare il pool di candidati e portare a un trapianto sicuro nei pazienti oncologici. I vantaggi di questo modello murino sono il suo rapporto costo-efficacia e l’ampia disponibilità di dati immunologici e reagenti.
I team che lavorano su regimi di trattamento immunosoppressivo per il trapianto laringeo possono utilizzare questo metodo per raccogliere un grande volume di dati immunologici e diversi regimi farmacologici possono essere rapidamente testati e confrontati. Altre potenziali modalità di trattamento che possono modulare la risposta immunitaria al trapianto, come le iniezioni di cellule staminali, possono anche essere testate utilizzando questo modello. Infine, possono essere ideati esperimenti per osservare gli effetti sistemici a lungo termine del trapianto laringeo estendendo il periodo di follow-up.
La tecnica qui descritta utilizza anastomosi end-to-side per fornire flusso arterioso e venoso a un innesto eterotopico di laringe. L’innesto è un complesso laringotracheoesofageo (LTE) che comprende la laringe, le ghiandole tiroidee, le ghiandole paratiroidi, la trachea e l’esofago del donatore, con arterie carotidi bilaterali e peduncoli intatti. Un’arteria carotide donatrice è anastomizzata all’arteria carotide ricevente e fornisce il flusso sanguigno arterioso, mentre l’altra arteria carotide donatrice è anastomizzata alla vena giugulare esterna ricevente e fornisce il flusso sanguigno venoso (Figura 1).
Sono state apportate diverse modifiche alla tecnica chirurgica del modello di ratto per garantire il successo nel modello murino. Ad esempio, è stato utilizzato un agente anestetico inalato al posto di un agente iniettabile per aumentare il controllo sulla profondità dell’anestesia e ridurre le complicanze. La sutura continua viene utilizzata nell’anastomosi arterioso-arteriosa nei ratti; Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte dei vasi del topo, questo è tecnicamente difficile e può causare il restringimento del lume 7 del vaso. Di conseguenza, le suture interrotte vengono utilizzate nel modello murino e migliorano la pervietà del vaso. Inoltre, nel modello di ratto, il peduncolo dell’arteria tiroidea superiore (STA) viene sezionato e visualizzato. Date le dimensioni più piccole della STA nei topi, questa dissezione potrebbe causare danni e persino la transezione dello STA. Di conseguenza, non viene sezionato nel modello murino. Invece, la fascia vicina viene preservata per garantire che la STA sia mantenuta intatta.
Le principali potenziali insidie di questa tecnica includono il danneggiamento dei peduncoli complessi LTE del donatore, l’arteriotomia o la venotomia di dimensioni errate, l’occlusione dei vasi nei siti di anastomosi o il lasciare spazi vuoti nei siti di anastomosi che possono causare sanguinamento. Per evitare questi passi falsi, è necessario prestare attenzione quando si procura l’innesto del donatore lasciando un bracciale di tessuto attorno al peduncolo STA. L’arteriotomia e la venotomia dovrebbero essere abbastanza grandi da consentire il flusso sanguigno, ma abbastanza piccole da prevenire perdite. Un numero appropriato di punti di sutura dovrebbe essere usato per le anastomosi per chiudere eventuali spazi vuoti, ma non troppi per occludere i vasi.
Se si ottiene familiarità con le tecniche microchirurgiche, questa procedura può essere eseguita in circa 3 ore. Questo modello di trapianto laringeo può essere eseguito in modo affidabile nei topi e utilizzato per studiare la risposta immunitaria dell’ospite dopo allotrapianto composito vascolarizzato.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’incidenza e la prevalenza del cancro della laringe sono aumentate rispettivamente del 12% e del 24% negli ultimi tre decenni e molti di questi pazienti subiscono una laringectomia per il trattamento10. Questa procedura peggiora significativamente la qualità della vita di una persona e quindi è necessario un trattamento alternativo. L’allotrapianto composito vascolarizzato della laringe può migliorare la capacità del paziente di respirare e parlare; Tuttavia, la ricerca è ancora necessaria p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Randall Raish per la sua eccellente videografia e assistenza al montaggio.
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
Referências
- Strome, M., et al. Laryngeal transplantation and 40-month follow-up. The New England Journal of Medicine. 344 (22), 1676-1679 (2001).
- Hilgers, F. J. M., Ackerstaff, A. H., Aaronson, N. K., Schouwenburg, P. F., Zandwijk, N. Physical and psychosocial consequences of total laryngectomy. Clinical Otolaryngology. 15 (5), 421-425 (1990).
- Heyes, R., Iarocci, A., Tchoukalova, Y., Lott, D. G. Immunomodulatory role of mesenchymal stem cell therapy in vascularized composite allotransplantation. Journal of Transplantation. 2016, (2016).
- Kluyskens, P., Ringoir, S. Follow-up of a human larynx transplantation. Laryngoscope. 80 (8), 1244-1250 (1970).
- Krishnan, G., et al. The current status of human laryngeal transplantation in 2017: A state of the field review. Laryngoscope. 127 (8), 1861-1868 (2017).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), 950-953 (1992).
- Lorenz, R. R., Dan, O., Nelson, M., Fritz, M. A., Strome, M. Rat laryngeal transplant model: technical advancements and a redefined rejection grading system. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 111 (12), 1120-1127 (2002).
- Shipchandler, T. Z., et al. New mouse model for studying laryngeal transplantation. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 118 (6), 465-468 (2009).
- Strome, M., Wu, J., Strome, S., Brodsky, G. A comparison of preservation techniques in a vascularized rat laryngeal transplant model. The Laryngoscope. 104 (6), 666-668 (1994).
- Nocini, R., Molteni, G., Mattiuzzi, C., Lippi, G. Updates on larynx cancer epidemiology. Chinese Journal of Cancer Research. 32 (1), 18-25 (2020).
- Strome, S., Sloman-Moll, E., Wu, J., Samonte, B. R., Strome, M. Rat model for a vascularized laryngeal allograft. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (11), (1992).
- Work, W. P., Boles, R. Larynx: Replantation in the dog. Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 82 (4), 401-402 (1965).
- Birchall, M. A., et al. Model for experimental revascularized laryngeal allotransplantation. British Journal of Surgery. 89 (11), 1470-1475 (2002).
- Nakai, K., et al. Rat model of laryngeal transplantation with normal circulation maintained by combination with the tongue. Microsurgery. 23 (2), 135-140 (2003).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Long-term laryngeal allograft survival using low-dose everolimus. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 142 (1), 72-78 (2010).
- Lott, D. G., Russell, J. O., Khariwala, S. S., Dan, O., Strome, M. Ten-month laryngeal allograft survival with use of pulsed everolimus and anti-αβ T-cell receptor antibody immunosuppression. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 120 (2), 131-136 (2011).
- Lott, D. G., Dan, O., Lu, L., Strome, M. Decoy NF-κB fortified immature dendritic cells maintain laryngeal allograft integrity and provide enhancement of regulatory T cells. The Laryngoscope. 120 (1), 44-52 (2010).
