Un modelo heterotópico de ratón para estudiar el trasplante de laringe
Summary
El objetivo de este manuscrito es describir los pasos microquirúrgicos necesarios para realizar un trasplante de laringe heterotópico en ratones. Las ventajas de este modelo de ratón en comparación con otros modelos animales de trasplante de laringe son su costo-efectividad y la disponibilidad de ensayos y datos inmunológicos.
Abstract
El trasplante heterotópico laríngeo, aunque es un procedimiento técnicamente desafiante, ofrece más análisis científicos y beneficios de costos en comparación con otros modelos animales. Aunque fue descrita por primera vez por Shipchandler et al. en 2009, esta técnica no es ampliamente utilizada, posiblemente debido a las dificultades para aprender la técnica microquirúrgica y el tiempo requerido para dominarla. Este documento describe los pasos quirúrgicos en detalle, así como las posibles trampas a evitar, con el fin de fomentar el uso eficaz de esta técnica.
En este modelo, las arterias carótidas bilaterales de la laringe del donante se anastomosan a la arteria carótida receptora y a la vena yugular externa, lo que permite el flujo sanguíneo a través del injerto. El flujo sanguíneo se puede confirmar intraoperatoriamente mediante la visualización del llenado de sangre en las arterias carótidas bilaterales del injerto, el enrojecimiento de las glándulas tiroides del injerto y el sangrado de los microvasos en el injerto. Los elementos cruciales para el éxito incluyen la delicada preservación de los vasos del injerto, la realización del tamaño correcto de arteriotomía y venotomía, y el uso del número apropiado de suturas en las anastomosis arterial-arterial y arterial-venosa para asegurar los vasos sin fugas y evitar la oclusión.
Cualquier persona puede dominar este modelo con suficiente capacitación y realizar el procedimiento en aproximadamente 3 h. Si se realiza con éxito, este modelo permite realizar estudios inmunológicos con facilidad y a bajo costo.
Introduction
Para los pacientes que sufren de daño laríngeo irreparable o cáncer de laringe, una laringectomía total es a menudo la única opción1. La laringectomía total deja a los pacientes sin la capacidad de respirar y hablar por sí mismos, además de experimentar angustia social y psicológica2. Los pacientes con cáncer de laringe que necesitan una laringectomía total son excelentes candidatos potenciales para el trasplante de laringe. Mientras que el trasplante laríngeo humano en el contexto de daño laríngeo irreparable ha sido realizado, el alotrasplante de la laringe se evita actualmente en estos pacientes debido al temor a la recurrencia tumoral, la posibilidad de rechazo crónico y las infecciones derivadas del donante3. La inmunosupresión es la causa principal de estas preocupaciones. La pérdida dramática del primer paciente con trasplante laríngeo parcial debido a la recidiva tumoral después del tratamiento inmunosupresor convencional es evidencia de que se debe diseñar un régimen inmunosupresor apropiado antes de realizar nuevos intentos de trasplante en pacientes con cáncer de laringe 4,5.
Para comprender mejor la respuesta inmune del huésped a una laringe trasplantada, el primer modelo de trasplante laríngeo en ratas fue desarrollado en 1992 por Strome, y las mejoras en la técnica quirúrgica se realizaron en 2002 6,7. Aunque este modelo es efectivo para estudiar el trasplante laríngeo, la falta de agentes inmunológicos específicos para ratas y el mayor costo asociado con los modelos de ratas llevaron al desarrollo de un nuevo modelo de ratón para estudiar el trasplante laríngeo en 20098.
La principal aplicación de la técnica descrita es estudiar diferentes regímenes farmacorrectores inmunosupresores en el trasplante laríngeo. La mejora de las terapias inmunosupresoras actuales puede ampliar el grupo de candidatos y dar lugar a un trasplante seguro en pacientes con cáncer. Los beneficios de este modelo de ratón son su rentabilidad y la amplia disponibilidad de datos inmunológicos y reactivos.
Los equipos que trabajan en regímenes de tratamiento inmunosupresores para el trasplante de laringe pueden usar este método para recopilar un gran volumen de datos inmunológicos, y se pueden probar y comparar rápidamente diferentes regímenes farmacológicos. Otras posibles modalidades de tratamiento que pueden modular la respuesta inmune al trasplante, como las inyecciones de células madre, también se pueden probar utilizando este modelo. Finalmente, se pueden diseñar experimentos para observar los efectos sistémicos a largo plazo del trasplante de laringe mediante la extensión del período de seguimiento.
La técnica descrita aquí utiliza anastomosis de extremo a lado para proporcionar flujo arterial y venoso a un injerto de laringe heterotópico. El injerto es un complejo laringotraqueoesofágico (LTE) que comprende la laringe, las glándulas tiroides, las glándulas paratiroides, la tráquea y el esófago del donante, con arterias carótidas bilaterales y pedículos intactos. Una arteria carótida del donante se anastomosa a la arteria carótida receptora y proporciona flujo sanguíneo arterial, mientras que la otra arteria carótida del donante se anastomosa a la vena yugular externa receptora y proporciona flujo sanguíneo venoso (Figura 1).
Se realizaron varias modificaciones a la técnica quirúrgica del modelo de rata para asegurar el éxito en el modelo de ratón. Por ejemplo, se utilizó un agente anestésico inhalado en lugar de un agente inyectable para aumentar el control sobre la profundidad de la anestesia y reducir las complicaciones. La sutura continua se utiliza en la anastomosis arterial-arterial en ratas; Sin embargo, debido al tamaño más pequeño de los vasos de ratón, esto es técnicamente difícil y puede causar estrechamiento de la luz del vaso7. Como resultado, las suturas interrumpidas se utilizan en el modelo de ratón y dan como resultado una mejor permeabilidad de los vasos. Además, en el modelo de rata, el pedículo de la arteria tiroidea superior (STA) se disecciona y visualiza. Dado el tamaño más pequeño del STA en ratones, esta disección podría resultar en daño e incluso transección del STA. Como resultado, no se disecciona en el modelo de ratón. En cambio, la fascia cercana se conserva para garantizar que el STA se mantenga intacto.
Las principales dificultades potenciales de esta técnica incluyen dañar los pedículos del complejo LTE del donante, hacer una arteriotomía o venotomía de tamaño incorrecto, oclusión de vasos en los sitios de anastomosis o dejar huecos en los sitios de anastomosis que pueden causar sangrado. Para evitar estos errores, se debe tener cuidado al obtener el injerto del donante dejando un manguito de tejido alrededor del pedículo STA. La arteriotomía y la venotomía deben ser lo suficientemente grandes como para permitir el flujo sanguíneo, pero lo suficientemente pequeñas como para evitar fugas. Se debe usar un número apropiado de suturas para que las anastomosis cierren cualquier brecha, pero no demasiadas para ocluir los vasos.
Si se obtiene familiaridad con las técnicas microquirúrgicas, este procedimiento se puede realizar en aproximadamente 3 h. Este modelo de trasplante laríngeo se puede realizar de forma fiable en ratones y utilizarse para estudiar la respuesta inmune del huésped después del alotrasplante compuesto vascularizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La incidencia y prevalencia de cáncer de laringe han aumentado en 12% y 24%, respectivamente, durante las últimas tres décadas, y muchos de estos pacientes se someten a una laringectomía para el tratamiento10. Este procedimiento empeora significativamente la calidad de vida de una persona y, por lo tanto, se desea un tratamiento alternativo. El alotrasplante compuesto vascularizado de la laringe puede mejorar la capacidad del paciente para respirar y hablar; Sin embargo, todavía se requiere i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Randall Raish por su excelente videografía y asistencia de edición.
Materials
| #1 Paperclips | Staples | OP-7404 | Clips are shaped manually to be used as retractors |
| 1 cc Insulin Syringes | BD | 329412 | 27 G 5/8 |
| 10-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2870G | |
| 25 G Precision Glide Needle | BD | 305125 | 1 in |
| 3 mL Luer-Lok Tip Syringe | BD | 309657 | |
| 30 G Sterile Standard Blunt Needles | Cellink | NZ5300505001 | |
| 5-0 Monocryl Suture | Ethicon | Y822G | |
| 8-0 Ethilon Nylon Suture | Ethicon | 2815G | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | Straight, 1 x 2 teeth |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-10 | 19 mm, 10 cm, straight |
| Angled Forceps | Fine Science Tools | 00109-11 | 45/11 cm |
| Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 59399-162-35 | |
| Bandaid Fabric Fingertip | Cardinal Healthcare | 299399 | |
| Betadine Solution Swabsticks | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Buprenex Injection | CIII | 12495-0757-1 | 0.3 mg/mL |
| Clamp applying forceps without lock | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.CAF5 | 14 cm |
| Cotton Swabs | Puritan | 10806-001-PK | |
| DeBakey forceps | |||
| Dermabond Mini | Cardinal Healthcare | 315999 | |
| Dissecting Boards | Mopec | 22-444-314 | |
| Falcon Sterile Disposable Petri Dish | Corning | 25373-041 | 35 mm |
| Fine Scisssors | Fine Science Tools | 14029-10 | Curved Sharp-Blunt 10 cm |
| Golden A5 2-Speed Blade Clipper | Oster | 008OST-78005-140 | #10 |
| Hair Remover Sensitive Formula | Nair | 2260000033 | |
| Heparin | Meitheal Pharmaceuticals | 71288-4O2-10 | 10,000 USP units per 10 mL |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | 66794-013-25 | |
| Low-Temp Micro Fine Tip Cautery | Bovie Medical | AA90 | |
| Mercian Visibility Background Material | Synovis Micro Companies | VB3 | Green |
| Microvascular Approximator Clamp without Frame | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11V | 0.4-1 mm Vessel Diameter |
| Mouse face mask kit | Xenotec | XRK-S | Small |
| Needle holder | S&T | C-14 W | 5.5", 8 mm, 0.4 mm |
| Press n' Seal | Glad | 70441 | |
| Scalpel | Braun | BA210 | 10 blade |
| Single Mini Vessel Clamp | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.ABB11M | .31 (8 mm), 3 x 1 mm Rnd. Bl., Black Pair |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| Sterile Disposable Drape Sheets | Dynarex | DYN4410-CASE | |
| Sterile Gauze Pads | Dukal | 1212 | |
| Sterile Saline | Hospira | 236173 | NaCl 0.9% |
| Sterile Surgical Gloves | Gammex | 851_A | |
| Straight Forceps | Fine Science Tools | 00108-11 | 11 cm |
| Tissue forceps | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.JFLP3 | 13.5 cm, 8 mm, 0.3 mm |
| Vannas Pattern Scissors | Accurate Surgical & Scientific Instruments | ASSI.SDC15RV | 15 cm, 8 mm, curved 7mm blade |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-10 | 3 mm cutting edge, curved |
| Vessel Dilator Tip | Fine Science Tools | 00126-11 | Diameter 0.1 mm/Angled 10/11 cm |
| Vessel Dilator, Classic line | S&T | D-5a.3 W | 9 mm, 0.3 mm, angled 10 |
Referências
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