Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Summary

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Abstract

La microscopía de tracción por micropatrones permite controlar la forma de células individuales y grupos celulares. Además, la capacidad de modelar a escala de longitud micrométrica permite el uso de estas zonas de contacto modeladas para la medición de las fuerzas de tracción, ya que cada punto micromodelado permite la formación de una sola adhesión focal que luego deforma el hidrogel blando subyacente. Este enfoque se ha utilizado para una amplia gama de tipos de células, incluidas las células endoteliales, las células del músculo liso, los fibroblastos, las plaquetas y las células epiteliales.

Esta revisión describe la evolución de las técnicas que permiten la impresión de proteínas de la matriz extracelular en hidrogeles de poliacrilamida en una matriz regular de puntos de tamaño y espaciado preespecificados. Como los patrones de escala micrométrica son difíciles de imprimir directamente sobre sustratos blandos, los patrones se generan primero en cubiertas de vidrio rígido que luego se utilizan para transferir el patrón al hidrogel durante la gelificación. En primer lugar, se describe el enfoque original de impresión de microcontactos para generar matrices de pequeños puntos en el claváculo. Se requiere un segundo paso que elimina la mayor parte del patrón para dejar islas de puntos pequeños para controlar las formas de las células y los grupos de células en tales matrices de puntos modelados.

A continuación, se describe una evolución de este enfoque que permite la generación de islas de puntos utilizando un solo paso de patrón sustractivo. Este enfoque se simplifica en gran medida para el usuario, pero tiene la desventaja de una vida útil disminuida para el molde maestro necesario para hacer los patrones. Finalmente, se describen los enfoques computacionales que se han desarrollado para el análisis de imágenes de puntos desplazados y campos de tracción generados por células posteriores, y se proporcionan versiones actualizadas de estos paquetes de análisis.

Introduction

La mayoría de los fenotipos celulares ejercen fuerzas de tracción sobre su entorno. Estas fuerzas de tracción son generadas por el citoesqueleto contráctil de una célula, que es una red de actina y miosina, y otros biopolímeros filamentosos y proteínas^{de reticulación} 1,2,3,4. Las fuerzas generadas dentro de la célula pueden transmitirse al entorno extracelular o a las células adyacentes, principalmente a través de proteínas transmembrana como las integrinas y las cadherinas, respectivamente ^5,6. La forma en que una célula se propaga o contrae,y las magnitudes de las fuerzas de tracción asociadas a esos movimientos– es el resultado de una conversación íntima con su entorno, que depende en gran medida del tipo y cantidad de proteína presente en la matriz extracelular (ECM)^7,8 y de la rigidez de la ECM. De hecho, la microscopía de fuerza de tracción se ha convertido en una herramienta invaluable para comprender la capacidad de respuesta de las células a estímulos locales como la rigidez del sustrato, las tensiones y tensiones mecánicas impuestas o el contacto con otras células. Esta información es directamente relevante para la comprensión de enfermedades como el cáncer y^{el asma} 9,10,11,12.

Se requiere un sistema que se pueda utilizar para medir la deformación inducida por la fuerza de un sustrato de propiedades de material conocidas para calcular las fuerzas de tracción. Estos cambios deben rastrearse a lo largo del tiempo, lo que requiere técnicas de procesamiento de imágenes e imágenes. Uno de los primeros métodos utilizados para determinar las fuerzas de tracción celular fue la observación y análisis de la contracción de hidrogeles de colágeno sembrados con células, aunque este método fue solo semicuantitativo¹³. Otro método más refinado fue medir las fuerzas de tracción ejercidas por células individuales determinando las fuerzas resultantes de la deformación de una lámina delgada de silicona¹⁴. Posteriormente, se desarrollaron técnicas de medición más cuantitativas, y estos métodos también permitieron el uso de hidrogeles blandos como la poliacrilamida (PAA)12,15,16. Cuando se utilizan estos materiales blandos, las fuerzas de tracción podrían determinarse a partir del desplazamiento inducido por la fuerza de perlas desplazadas aleatoriamente incrustadas en el hidrogel y las propiedades mecánicas del gel^16,17. Otro avance vino con el desarrollo de matrices de micropostes hechas de polidimetilsiloxano blando (PDMS) para que su deflexión pudiera medirse y convertirse en fuerza utilizando la teoría del haz¹⁸.

Finalmente, se desarrollaron métodos para micromodelar hidrogeles blandos, ya que estos enfoques permiten el control de las áreas de contacto para la adhesión celular. Al medir la deformación del micromodelo dentro del área de contacto de una célula, las fuerzas de tracción podrían calcularse fácilmente porque no se requiere una imagen de referencia libre de fuerza¹⁹. Este método ha sido ampliamente adoptado, ya que permite el modelado indirecto de una matriz regular de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes discretas del tamaño de micras en geles PAA para la medición de fuerzas de tracción celular²⁰. Para calcular estas fuerzas, se ha desarrollado un algoritmo de procesamiento de imágenes, que puede rastrear los movimientos de cada punto micropatronado sin requerir la entrada del usuario²¹.

Si bien este método es simple para crear cuadrículas completas de patrones de puntos, es más complicado cuando se desean patrones de parches aislados (o islas) de puntos. Las islas micropatronadas son útiles cuando se necesita el control de la forma, y en cierta medida del tamaño, de los grupos de células. Para crear estas islas, el método mencionado de impresión de microcontactos requiere dos pasos distintos: i) usar un sello PDMS para crear un patrón de puntos de alta fidelidad en un coverslip, y luego ii) usar un segundo sello PDMS diferente para eliminar la mayoría de esos puntos, dejando atrás islas aisladas de puntos²¹. La dificultad de crear islas con este método original se ve agravada por el hecho de que hacer patrones de cuadrícula consistentes en el primer paso del proceso es un desafío por sí solo. Los sellos de microimpresión se componen de una matriz de micropostos circulares, cuyo diámetro corresponde al tamaño de punto deseado. Estos sellos se recubren con una capa uniforme de proteína y luego se estampan con una cantidad precisa de presión sobre las cubiertas tratadas para crear el patrón deseado. Por un lado, aplicar demasiada presión al sello puede resultar en una transferencia desigual de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente debido al pandeo o flacidez del pilar entre los pilares, lo que lleva al contacto con el vidrio. Por otro lado, aplicar muy poca presión resulta en poca o ninguna transferencia de proteínas y una fidelidad de patrón deficiente. Por estas razones, se desea un proceso de transferencia que se pueda utilizar para crear constantemente micropatrones de alta calidad de islas aisladas de puntos en un solo paso.

Aquí, se describe un método para el micropatronaje indirecto de islas de puntos de adhesión de proteínas fluorescentes del tamaño de micras en un gel PAA que es más consistente y versátil que los métodos desarrollados anteriormente. Mientras que los métodos de micropatronaje indirecto más antiguos se basan en la transferencia de patrones de proteínas de un sello PDMS a un sustrato intermedio, el método introducido aquí utiliza sellos PDMS en su lugar como un recipiente para la eliminación de proteínas, no para la adición. Esto se hace cambiando primero fundamentalmente la estructura de los sellos PDMS utilizados. En lugar de hacer sellos que se componen de un patrón de pilares circulares espaciados uniformemente, los sellos se componen de un patrón de agujeros circulares espaciados uniformemente en este método.

Con esta nueva estructura, la superficie de estos sellos PDMS se puede tratar con glutaraldehído como se describió anteriormente^20,29,30, haciendo que el sello pueda unirse covalentemente con la proteína. Cuando se usan en una funda de vidrio recubierta uniformemente con proteína fluorescente, estos sellos PDMS tratados con glutaraldehído se utilizan para eliminar la mayor parte de la proteína en la superficie de la hoja de cubierta, dejando atrás solo el patrón deseado de puntos predeterminado por la ubicación de agujeros del tamaño de micras en el sello. Este cambio aumenta la tasa de éxito para generar patrones formados por una cuadrícula casi continua de puntos y para crear islas aisladas de puntos a través de un solo paso.

Protocol

1. Creación de maestros de silicona NOTA: La mayor parte del proceso de diseño, creación y solución de problemas de maestros de silicio para el moldeo repetido de sellos PDMS se ha cubierto anteriormente21, por lo que solo se describirán aquí las diferencias clave en este nuevo enfoque. Cree el diseño de la fotomáscara utilizando AutoCAD o un software de diseño similar. Cubra un lado de la fotomáscara, una pieza delgada de vidrio, co…

Representative Results

Los hidrogeles PAA con el módulo de Young de E = 3,6 kPa y la relación de Poisson de ν = 0,445 se hicieron para su uso mediante este método de micropatronaje sustractivo. Los hidrogeles se hicieron para tener ~ 100 μm de espesor, lo que les permite ser fotografiados con la configuración de imágenes utilizada aquí, al tiempo que evita que las células detecten el capa rígida debajo del gel, lo que causaría problemas en los estudios centrados en la detección de rigidez celular…

Discussion

En este documento se describe un método mejorado de modelado indirecto de hidrogeles PAA. Este enfoque se basa en métodos que se han utilizado anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. El cambio principal es que los sell…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40