توليد النمط لمجهر الجر المجهري
Summary
نحن نصف التحسينات التي أدخلت على طريقة قياسية لقياس قوى الجر الخلوي ، استنادا إلى طباعة التلامس الدقيق مع خطوة نقش طرح واحدة من صفائف نقطية من بروتينات المصفوفة خارج الخلية على الهلاميات المائية اللينة. تسمح هذه الطريقة بتصنيع أبسط وأكثر اتساقا لأنماط الجزر ، وهو أمر ضروري للتحكم في شكل مجموعة الخلايا.
Abstract
يسمح الفحص المجهري للجر المجهري بالتحكم في شكل الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على النمط على مقياس طول الميكرومتر تسمح باستخدام مناطق التلامس المنقوشة هذه لقياس قوى الجر ، حيث تسمح كل نقطة مجهرية بتكوين التصاق بؤري واحد يشوه بعد ذلك الهيدروجيل الناعم الأساسي. وقد استخدم هذا النهج لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية، والصفائح الدموية، والخلايا الظهارية.
تصف هذه المراجعة تطور التقنيات التي تسمح بطباعة بروتينات المصفوفة خارج الخلية على هيدروجيل بولي أكريلاميد في مجموعة منتظمة من النقاط ذات الحجم والتباعد المحددين مسبقا. نظرا لأنه من الصعب طباعة أنماط مقياس الميكرومتر مباشرة على ركائز ناعمة ، يتم إنشاء الأنماط أولا على أغطية زجاجية صلبة يتم استخدامها بعد ذلك لنقل النمط إلى الهيدروجيل أثناء الهلام. أولا ، يتم وصف نهج الطباعة microcontact الأصلي لإنشاء صفائف من النقاط الصغيرة على coverslip. هناك حاجة إلى خطوة ثانية تزيل معظم النمط لترك جزر من النقاط الصغيرة للتحكم في أشكال الخلايا ومجموعات الخلايا على هذه المصفوفات من النقاط المنقوشة.
بعد ذلك ، يتم وصف تطور هذا النهج الذي يسمح بتوليد جزر من النقاط باستخدام خطوة نمط طرح واحدة. يتم تبسيط هذا النهج إلى حد كبير للمستخدم ولكن له عيب انخفاض العمر الافتراضي للقالب الرئيسي اللازم لصنع الأنماط. وأخيرا، يتم وصف النهج الحسابية التي تم تطويرها لتحليل صور النقاط النازحة وحقول الجر اللاحقة التي تولدها الخلايا، ويتم توفير نسخ محدثة من حزم التحليل هذه.
Introduction
تمارس معظم الأنماط الظاهرية للخلايا قوى الجر على بيئتها. يتم توليد قوى الجر هذه بواسطة الهيكل الخلوي المتقلص للخلية ، وهو عبارة عن شبكة من الأكتين والميوسين ، والبوليمرات الحيوية الخيطية الأخرى والبروتينات المتقاطعة1،2،3،4. يمكن أن تنتقل القوى المتولدة داخل الخلية إلى البيئة خارج الخلية أو الخلايا المجاورة ، في المقام الأول عن طريق البروتينات عبر الغشاء مثل integrins و cadherins ، على التوالي 5,6. إن كيفية انتشار الخلية أو انكماشها – وأحجام قوى الجر المرتبطة بتلك الحركات – هي نتيجة لمحادثة حميمة مع بيئتها ، والتي تعتمد إلى حد كبير على نوع وكمية البروتين الموجود في المصفوفة خارج الخلية (ECM) 7,8 وصلابة ECM. في الواقع ، أصبح الفحص المجهري لقوة الجر أداة لا تقدر بثمن لفهم استجابة الخلايا للمحفزات المحلية مثل صلابة الركيزة ، أو الضغوط الميكانيكية المفروضة والسلالات ، أو الاتصال بالخلايا الأخرى. هذه المعلومات ذات صلة مباشرة بفهم أمراض مثل السرطان والربو9،10،11،12.
مطلوب نظام يمكن استخدامه لقياس التشوه الناجم عن القوة لركيزة من خصائص المواد المعروفة لحساب قوى الجر. يجب تتبع هذه التغييرات بمرور الوقت ، مما يتطلب تقنيات التصوير ومعالجة الصور. كانت إحدى الطرق الأولى المستخدمة لتحديد قوى الجر الخلوي هي مراقبة وتحليل تقلص هيدروجيل الكولاجين المزروع بالخلايا ، على الرغم من أن هذه الطريقة كانت شبه كميةفقط 13. طريقة أخرى أكثر دقة هي قياس قوى الجر التي تمارسها الخلايا المفردة عن طريق تحديد القوى الناتجة عن تشوه ورقة رقيقة من السيليكون14. في وقت لاحق ، تم تطوير المزيد من تقنيات القياس الكمي ، وسمحت هذه الطرق أيضا باستخدام الهلاميات المائية اللينة مثل polyacrylamide (PAA) 12،15،16. عند استخدام هذه المواد اللينة ، يمكن تحديد قوى الجر من الإزاحة الناجمة عن القوة للخرز النازح عشوائيا المضمن في الهيدروجيل والخواص الميكانيكية للهلام16,17. وجاء تقدم آخر مع تطوير صفائف micropost مصنوعة من البولي ديميثيل سيلوكسان الناعم (PDMS) بحيث يمكن قياس انحرافها وتحويله إلى قوة باستخدام نظرية الحزمة18.
وأخيرا ، تم تطوير طرق للتنميط الدقيق للهيدروجيل اللينة لأن هذه الأساليب تسمح بالتحكم في مناطق التلامس للالتصاق الخلايا. من خلال قياس تشوه النمط المجهري داخل منطقة ملامسة الخلية ، يمكن بسهولة حساب قوى الجر لأن الصورة المرجعية الخالية من القوة ليست مطلوبة19. تم اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع لأنها تسمح بالتنميط غير المباشر لمجموعة منتظمة من نقاط التصاق البروتين الفلوري المنفصلة بحجم ميكرون على المواد الهلامية PAA لقياس قوى الجر الخلوي20. لحساب هذه القوى ، تم تطوير خوارزمية معالجة الصور ، والتي يمكنها تتبع حركات كل نقطة دقيقة دون الحاجة إلى إدخال المستخدم ،21.
في حين أن هذه الطريقة بسيطة لإنشاء شبكات كاملة من أنماط النقاط ، إلا أنها أكثر تعقيدا عندما تكون أنماط البقع المعزولة (أو الجزر) من النقاط مطلوبة. الجزر ذات الأنماط الدقيقة مفيدة عندما تكون هناك حاجة إلى التحكم في شكل مجموعات الخلايا ، وإلى حد ما من حيث الحجم. لإنشاء هذه الجزر ، تتطلب الطريقة المذكورة أعلاه للطباعة microcontact خطوتين متميزتين: i) استخدام ختم PDMS واحد لإنشاء نمط عالي الدقة من النقاط على غطاء ، ثم ii) استخدام ختم PDMS مختلف ثان لإزالة معظم تلك النقاط ، تاركا وراءه جزرا معزولة من النقاط21. وتتفاقم صعوبة إنشاء الجزر بهذه الطريقة الأصلية بسبب حقيقة أن إنشاء أنماط شبكة متسقة في الخطوة الأولى من العملية يمثل تحديا من تلقاء نفسه. تتكون طوابع الطباعة الدقيقة من مجموعة من الأعمدة الدقيقة الدائرية ، التي يتوافق قطرها مع حجم النقطة المطلوب. ثم يتم طلاء هذه الطوابع بطبقة متساوية من البروتين ثم يتم ختمها بكمية دقيقة من الضغط على الأغطية المعالجة لإنشاء النمط المطلوب. من ناحية ، يمكن أن يؤدي تطبيق الكثير من الضغط على الختم إلى نقل البروتين بشكل غير متساو وضعف دقة النمط بسبب التواء العمود أو ترهله بين الأعمدة ، مما يؤدي إلى ملامسة الزجاج. من ناحية أخرى ، يؤدي تطبيق ضغط قليل جدا إلى نقل البروتين أو عدم نقله على الإطلاق وضعف دقة الأنماط. لهذه الأسباب ، من المرغوب فيه إجراء عملية نقل يمكن استخدامها لإنشاء أنماط دقيقة عالية الجودة باستمرار لجزر النقاط المعزولة في خطوة واحدة فقط.
هنا ، يتم وصف طريقة للتنميط الدقيق غير المباشر لجزر من نقاط التصاق البروتين الفلوري بحجم ميكرون على هلام PAA أكثر اتساقا وتنوعا من الطرق التي تم تطويرها سابقا. في حين أن طرق التنميط المجهري غير المباشرة القديمة تعتمد على نقل أنماط البروتين من ختم PDMS إلى ركيزة وسيطة ، فإن الطريقة المقدمة هنا تستخدم طوابع PDMS بدلا من ذلك كوعاء لإزالة البروتين ، وليس الإضافة. يتم ذلك عن طريق تغيير هيكل طوابع PDMS المستخدمة بشكل أساسي. بدلا من صنع الطوابع التي تتكون من نمط من الأعمدة الدائرية المتباعدة بالتساوي ، تتكون الطوابع من نمط من الثقوب الدائرية المتباعدة بالتساوي في هذه الطريقة.
مع هذا الهيكل الجديد ، يمكن بعد ذلك معالجة سطح طوابع PDMS هذه باستخدام glutaraldehyde كما هو موضح سابقا20,29,30 ، مما يجعل الطابع قادرا على الارتباط تساهميا مع البروتين. عند استخدامها على غطاء زجاجي مطلي بالتساوي بالبروتين الفلورسنت ، يتم استخدام طوابع PDMS المعالجة بالغوتارالدهيد لإزالة معظم البروتين الموجود على سطح الغطاء ، تاركة وراءها فقط النمط المطلوب من النقاط المحددة مسبقا من خلال موقع الثقوب بحجم ميكرون على الختم. يزيد هذا التغيير من معدل النجاح لتوليد أنماط تتكون من شبكة شبه مستمرة من النقاط وإنشاء جزر معزولة من النقاط من خلال خطوة واحدة فقط.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم وصف طريقة محسنة لنمط المواد الهلامية المائية PAA بشكل غير مباشر في هذه الورقة. يعتمد هذا النهج على الأساليب التي تم استخدامها سابقا 20,35,36,37,38,39,40,41,42.<sup class…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور بول باربون من قسم الهندسة الميكانيكية بجامعة بوسطن على المناقشات المفيدة والمساعدة في تحليل البيانات. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة NSF CMMI-1910401.
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
Referências
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
- Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
- Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
- Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
- Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
- Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
- Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
- Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
- . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
- Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
- Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
- Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
- Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
- Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
- Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
- Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
- Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
- Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
- Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
- Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
- Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
- Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
- Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).
