Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Summary

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Abstract

Micropattern tractiemicroscopie maakt controle van de vorm van enkele cellen en celclusters mogelijk. Bovendien maakt de mogelijkheid om op de micrometerlengteschaal te patroon het gebruik van deze patrooncontactzones mogelijk voor het meten van tractiekrachten, omdat elke microgepatterde stip de vorming van een enkele focale adhesie mogelijk maakt die vervolgens de zachte, onderliggende hydrogel vervormt. Deze aanpak is gebruikt voor een breed scala aan celtypen, waaronder endotheelcellen, gladde spiercellen, fibroblasten, bloedplaatjes en epitheelcellen.

Deze review beschrijft de evolutie van technieken die het mogelijk maken om extracellulaire matrixeiwitten op polyacrylamidehydrogels te printen in een regelmatige reeks stippen van vooraf gespecificeerde grootte en afstand. Omdat patronen op micrometerschaal moeilijk direct op zachte substraten kunnen worden afgedrukt, worden patronen eerst gegenereerd op stijve glazen afdekkingsplaten die vervolgens worden gebruikt om het patroon tijdens de gelation naar de hydrogel over te brengen. Eerst wordt de oorspronkelijke microcontactprintbenadering beschreven om arrays van kleine stippen op de coverslip te genereren. Een tweede stap die het grootste deel van het patroon verwijdert om eilanden van kleine stippen te verlaten, is nodig om de vormen van cellen en celclusters op dergelijke arrays van patroonstippen te regelen.

Vervolgens wordt een evolutie van deze benadering beschreven die het mogelijk maakt om eilanden van stippen te genereren met behulp van een enkele subtractieve patroonstap. Deze aanpak is sterk vereenvoudigd voor de gebruiker, maar heeft het nadeel van een kortere levensduur voor de hoofdmal die nodig is om de patronen te maken. Ten slotte worden de computationele benaderingen beschreven die zijn ontwikkeld voor de analyse van afbeeldingen van verplaatste stippen en daaropvolgende door cellen gegenereerde tractievelden en worden bijgewerkte versies van deze analysepakketten verstrekt.

Introduction

De meeste celfenotypen oefenen tractiekrachten uit op hun omgeving. Deze trekkrachten worden gegenereerd door het contractiele cytoskelet van een cel, een netwerk van actine en myosine, en andere filamenteuze biopolymeren en crosslinking eiwitten 1,2,3,4. Krachten die in de cel worden gegenereerd, kunnen worden overgedragen op de extracellulaire omgeving of aangrenzende cellen, voornamelijk via transmembraaneiwitten zoals respectievelijk integrinen en cadherinen ^5,6. Hoe een cel zich verspreidt of samentrekt – en de grootte van de tractiekrachten die met die bewegingen gepaard gaan – is het resultaat van een intiem gesprek met zijn omgeving, dat grotendeels afhangt van het type en de hoeveelheid eiwit dat aanwezig is in de extracellulaire matrix (ECM)^7,8 en de stijfheid van de ECM. Tractiekrachtmicroscopie is inderdaad een waardevol hulpmiddel geworden voor het begrijpen van de reactiesnelheid van cellen op lokale stimuli zoals substraatstijfheid, opgelegde mechanische spanningen en spanningen, of contact met andere cellen. Deze informatie is direct relevant voor het begrip van ziekten zoals kanker en astma 9,10,11,12.

Een systeem dat kan worden gebruikt om door kracht geïnduceerde vervorming van een substraat met bekende materiaaleigenschappen te meten, is vereist om tractiekrachten te berekenen. Deze veranderingen moeten in de loop van de tijd worden gevolgd, waarvoor zowel beeldvormings- als beeldverwerkingstechnieken nodig zijn. Een van de eerste methoden die werd gebruikt om cellulaire tractiekrachten te bepalen, was de observatie en analyse van de contractie van collageenhydrogels bezaaid met cellen, hoewel deze methode slechts semikwantitatief was¹³. Een andere, meer verfijnde methode was het meten van de trekkrachten die door afzonderlijke cellen werden uitgeoefend door de krachten te bepalen die het gevolg waren van de vervorming van een dun vel siliconen¹⁴. Later werden meer kwantitatieve meettechnieken ontwikkeld en deze methoden maakten ook het gebruik van zachte hydrogels zoals polyacrylamide (PAA)12,15,16 mogelijk. Bij gebruik van deze zachte materialen konden tractiekrachten worden bepaald uit de door kracht geïnduceerde verplaatsing van willekeurig verplaatste kralen ingebed in de hydrogel en de mechanische eigenschappen van de gel ^16,17. Een andere vooruitgang kwam met de ontwikkeling van micropostarrays gemaakt van zacht polydimethylsiloxaan (PDMS), zodat hun afbuiging kon worden gemeten en omgezet in kracht met behulp van de bundeltheorie¹⁸.

Ten slotte werden methoden voor micropatterning van zachte hydrogels ontwikkeld, omdat deze benaderingen controle van de contactgebieden voor celadhesie mogelijk maken. Door de vervorming van het micropatroon binnen het contactgebied van een cel te meten, konden tractiekrachten eenvoudig worden berekend omdat een krachtvrij referentiebeeld niet nodig is¹⁹. Deze methode is op grote schaal toegepast omdat het de indirecte patroonvorming van een regelmatige reeks micron-sized, discrete fluorescerende eiwitadhesiepunten op PAA-gels mogelijk maakt voor het meten van cellulaire tractiekrachten²⁰. Om deze krachten te berekenen, is een beeldverwerkingsalgoritme ontwikkeld, dat de bewegingen van elke microgepatterde stip kan volgen zonder gebruikersinvoer te vereisen²¹.

Hoewel deze methode eenvoudig is voor het maken van hele rasters van puntpatronen, is het ingewikkelder wanneer patronen van geïsoleerde patches (of eilanden) van stippen gewenst zijn. Microgepatterde eilanden zijn nuttig wanneer controle van de vorm en tot op zekere hoogte van de grootte van clusters van cellen nodig is. Om deze eilanden te maken, vereist de bovengenoemde methode van microcontactafdrukken twee verschillende stappen: i) het gebruik van één PDMS-stempel om een high-fidelity patroon van stippen op een coverslip te maken, en vervolgens ii) het gebruik van een tweede verschillende PDMS-stempel om de meeste van die stippen te verwijderen, waardoor geïsoleerde eilanden van stippen²¹ achterblijven. De moeilijkheid om eilanden te creëren met deze originele methode wordt nog verergerd door het feit dat het maken van consistente rasterpatronen in de eerste stap van het proces op zichzelf een uitdaging is. Microprinting stempels zijn samengesteld uit een reeks cirkelvormige microposten, waarvan de diameter overeenkomt met de gewenste puntgrootte. Deze stempels worden vervolgens gecoat met een gelijkmatige laag eiwit en vervolgens met een precieze hoeveelheid druk op behandelde coverslips gestempeld om het gewenste patroon te creëren. Aan de ene kant kan het uitoefenen van te veel druk op de stempel resulteren in ongelijke eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid als gevolg van knikken of verzakkingen tussen pilaren, wat leidt tot contact met het glas. Aan de andere kant resulteert het uitoefenen van te weinig druk in weinig tot geen eiwitoverdracht en slechte patroongetrouwheid. Om deze redenen is een overdrachtsproces gewenst dat kan worden gebruikt om consequent hoogwaardige micropatronen van geïsoleerde eilanden van stippen in slechts één stap te maken.

Hierin wordt een methode beschreven voor het indirect micropatteren van eilanden van micron-formaat fluorescerende eiwitadhesiepunten op een PAA-gel die consistenter en veelzijdiger is dan eerder ontwikkelde methoden. Terwijl oudere indirecte micropatterningmethoden afhankelijk zijn van de overdracht van eiwitpatronen van een PDMS-stempel naar een tussensubstraat, gebruikt de hier geïntroduceerde methode PDMS-stempels in plaats daarvan als een vat voor eiwitverwijdering, niet voor toevoeging. Dit wordt gedaan door eerst de structuur van de gebruikte PDMS-stempels fundamenteel te veranderen. In plaats van stempels te maken die zijn samengesteld uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige pilaren, zijn stempels opgebouwd uit een patroon van gelijkmatig verdeelde cirkelvormige gaten in deze methode.

Met deze nieuwe structuur kan het oppervlak van deze PDMS-stempels vervolgens worden behandeld met glutaaraldehyde zoals eerder beschreven 20,29,30, waardoor de stempel covalent kan binden met eiwit. Bij gebruik op een glazen afdekplaat gelijkmatig gecoat met fluorescerend eiwit, worden deze met glutaaraldehyde behandelde PDMS-stempels gebruikt om het grootste deel van het eiwit op het oppervlak van de coverslip te verwijderen, waardoor alleen het gewenste patroon van stippen achterblijft dat vooraf wordt bepaald door de locatie van gaten ter grootte van micron op de stempel. Deze verandering verhoogt het slagingspercentage voor het genereren van patronen die bestaan uit een bijna continu raster van stippen en voor het creëren van geïsoleerde eilanden van stippen door slechts één stap.

Protocol

1. Creatie van siliconen masters OPMERKING: Het grootste deel van het proces van het ontwerp, de creatie en het oplossen van problemen met siliciummasters voor het herhaaldelijk vormen van PDMS-stempels is eerder behandeld21, dus alleen belangrijke verschillen in deze nieuwe aanpak zullen hier worden beschreven. Maak het ontwerp voor het fotomasker met Behulp van AutoCAD of soortgelijke ontwerpsoftware. Bedek één kant van het fotomasker, een…

Representative Results

PAA-hydrogels met de Young’s modulus van E = 3,6 kPa en de Poisson’s ratio van ν = 0,445 werden gemaakt voor gebruik door deze subtractieve micropatterning methode. De hydrogels zijn gemaakt om ~ 100 μm dik te zijn, waardoor ze kunnen worden afgebeeld met de beeldvormingsopstelling die hier wordt gebruikt, terwijl ook wordt voorkomen dat de cellen de stijve coverslip onder de gel detecteren, wat problemen zou veroorzaken in studies gericht op cellulaire stijfheidsdetectie23,33<…

Discussion

Een verbeterde methode voor het indirect patroon van PAA-hydrogels wordt in dit artikel beschreven. Deze aanpak bouwt voort op methoden die eerder zijn gebruikt 20,35,36,37,38,39,40,41,42. De belangrijkste verandering is d…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40