माइक्रोपैटर्न कर्षण माइक्रोस्कोपी के लिए पैटर्न जनरेशन
Summary
हम सेलुलर कर्षण बलों को मापने के लिए एक मानक विधि में सुधार का वर्णन करते हैं, जो नरम हाइड्रोजेल पर बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स प्रोटीन के डॉट सरणियों के एकल subtractive patterning चरण के साथ माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग पर आधारित है। यह विधि द्वीप पैटर्न के सरल और अधिक सुसंगत निर्माण के लिए अनुमति देती है, जो सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है।
Abstract
माइक्रोपैटर्न कर्षण माइक्रोस्कोपी एकल कोशिकाओं और सेल समूहों के आकार के नियंत्रण की अनुमति देती है। इसके अलावा, माइक्रोमीटर लंबाई पैमाने पर पैटर्न करने की क्षमता कर्षण बलों के माप के लिए इन पैटर्न वाले संपर्क क्षेत्रों के उपयोग की अनुमति देती है, क्योंकि प्रत्येक माइक्रोपैटर्नेड डॉट एक एकल फोकल आसंजन के गठन की अनुमति देता है जो तब नरम, अंतर्निहित हाइड्रोजेल को विकृत करता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग एंडोथेलियल कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, फाइब्रोब्लास्ट्स, प्लेटलेट्स और उपकला कोशिकाओं सहित सेल प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए किया गया है।
यह समीक्षा उन तकनीकों के विकास का वर्णन करती है जो पूर्व-निर्दिष्ट आकार और रिक्ति के डॉट्स की एक नियमित सरणी में पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोजेल पर एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स प्रोटीन के मुद्रण की अनुमति देती हैं। चूंकि माइक्रोमीटर-स्केल पैटर्न को सीधे नरम सब्सट्रेट पर प्रिंट करना मुश्किल होता है, इसलिए पैटर्न पहले कठोर ग्लास कवरलिप्स पर उत्पन्न होते हैं जो तब जेलेशन के दौरान हाइड्रोजेल में पैटर्न को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं। सबसे पहले, कवरस्लिप पर छोटे डॉट्स की सरणियों को उत्पन्न करने के लिए मूल माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। एक दूसरा कदम जो छोटे डॉट्स के द्वीपों को छोड़ने के लिए अधिकांश पैटर्न को हटा देता है, पैटर्न वाले डॉट्स के ऐसे सरणियों पर कोशिकाओं और सेल क्लस्टर के आकार को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है।
इसके बाद, इस दृष्टिकोण का एक विकास जो एकल subtractive patterning चरण का उपयोग करके डॉट्स के द्वीपों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, का वर्णन किया गया है। यह दृष्टिकोण उपयोगकर्ता के लिए बहुत सरलीकृत है, लेकिन पैटर्न बनाने के लिए आवश्यक मास्टर मोल्ड के लिए कम जीवनकाल का नुकसान है। अंत में, विस्थापित डॉट्स और बाद में सेल-जनित कर्षण क्षेत्रों की छवियों के विश्लेषण के लिए विकसित किए गए कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों का वर्णन किया गया है, और इन विश्लेषण पैकेजों के अद्यतन संस्करण प्रदान किए जाते हैं।
Introduction
अधिकांश सेल फेनोटाइप अपने पर्यावरण पर कर्षण बल लगाते हैं। ये कर्षण बल एक सेल के संकुचनशील साइटोस्केलेटन द्वारा उत्पन्न होते हैं, जो एक्टिन और मायोसिन का एक नेटवर्क है, और अन्य फिलामेंटस बायोपॉलिमर और क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन 1,2,3,4 है। सेल के भीतर उत्पन्न बलों को बाह्य कोशिकीय वातावरण या आसन्न कोशिकाओं में प्रेषित किया जा सकता है, मुख्य रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन जैसे कि इंटीग्रिन और कैडरिन के माध्यम से, क्रमशः 5,6। एक सेल कैसे फैलता है या अनुबंध करता है- और उन आंदोलनों से जुड़े कर्षण बलों के परिमाण- इसके पर्यावरण के साथ एक अंतरंग बातचीत का परिणाम है, जो काफी हद तक बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स (ईसीएम) 7,8 में मौजूद प्रोटीन के प्रकार और मात्रा और ईसीएम की कठोरता पर निर्भर करता है। दरअसल, कर्षण बल माइक्रोस्कोपी स्थानीय उत्तेजनाओं जैसे कि सब्सट्रेट कठोरता, लगाए गए यांत्रिक तनाव और उपभेदों, या अन्य कोशिकाओं के साथ संपर्क के लिए सेल जवाबदेही को समझने के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है। यह जानकारी कैंसर और अस्थमा जैसे रोगों की समझ के लिए सीधे प्रासंगिक है 9,10,11,12।
एक प्रणाली जिसका उपयोग ज्ञात सामग्री गुणों के सब्सट्रेट के बल-प्रेरित विरूपण को मापने के लिए किया जा सकता है, कर्षण बलों की गणना करने के लिए आवश्यक है। इन परिवर्तनों को समय के साथ ट्रैक किया जाना चाहिए, जिसमें इमेजिंग और छवि प्रसंस्करण तकनीकों दोनों की आवश्यकता होती है। सेलुलर कर्षण बलों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पहले तरीकों में से एक कोशिकाओं के साथ बीज वाले कोलेजन हाइड्रोजेल के संकुचन का अवलोकन और विश्लेषण था, हालांकि यह विधि केवल अर्धमात्रात्मक13 थी। एक और, अधिक परिष्कृत विधि सिलिकॉन14 की एक पतली शीट के विरूपण के परिणामस्वरूप बलों का निर्धारण करके एकल कोशिकाओं द्वारा लगाए गए कर्षण बलों को मापना था। बाद में, अधिक मात्रात्मक माप तकनीकों को विकसित किया गया था, और इन तरीकों ने नरम हाइड्रोजेल के उपयोग के लिए भी अनुमति दी थी जैसे कि पॉलीएक्रिलामाइड (पीएए) 12,15,16। इन नरम सामग्रियों का उपयोग करते समय, कर्षण बलों को हाइड्रोजेल में एम्बेडेड बेतरतीब ढंग से विस्थापित मोतियों के बल-प्रेरित विस्थापन और जेल16,17 के यांत्रिक गुणों से निर्धारित किया जा सकता है। एक और प्रगति नरम polydimethylsiloxane (PDMS) से बने माइक्रोपोस्ट सरणियों के विकास के साथ आई ताकि उनके विक्षेपण को मापा जा सके और बीम सिद्धांत18 का उपयोग करके बल में परिवर्तित किया जा सके।
अंत में, माइक्रोपैटर्निंग सॉफ्ट हाइड्रोजेल के लिए तरीके विकसित किए गए थे क्योंकि ये दृष्टिकोण सेल आसंजन के लिए संपर्क क्षेत्रों के नियंत्रण की अनुमति देते हैं। सेल के संपर्क क्षेत्र के भीतर माइक्रोपैटर्न के विरूपण को मापने से, कर्षण बलों की आसानी से गणना की जा सकती है क्योंकि बल-मुक्त संदर्भछवि की आवश्यकता नहीं होती है। इस विधि को व्यापक रूप से अपनाया गया है क्योंकि यह सेलुलर कर्षण बलों20 के माप के लिए पीएए जैल पर माइक्रोन-आकार, असतत फ्लोरोसेंट प्रोटीन आसंजन बिंदुओं की एक नियमित सरणी के अप्रत्यक्ष पैटर्निंग के लिए अनुमति देता है। इन बलों की गणना करने के लिए, एक छवि-प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म, जो उपयोगकर्ता इनपुट की आवश्यकता के बिना प्रत्येक माइक्रोपैटर्न्ड डॉट के आंदोलनों को ट्रैक कर सकता है,21 विकसित किया गया है।
जबकि यह विधि डॉट पैटर्न के पूरे ग्रिड बनाने के लिए सरल है, यह अधिक जटिल है जब डॉट्स के अलग-अलग पैच (या द्वीपों) के पैटर्न वांछित होते हैं। माइक्रोपैटर्न द्वीप उपयोगी होते हैं जब आकार का नियंत्रण, और आकार की कुछ हद तक, कोशिकाओं के समूहों की आवश्यकता होती है। इन द्वीपों को बनाने के लिए, माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग की उपर्युक्त विधि के लिए दो अलग-अलग चरणों की आवश्यकता होती है: i) एक कवरस्लिप पर डॉट्स का एक उच्च-निष्ठा पैटर्न बनाने के लिए एक पीडीएमएस स्टैंप का उपयोग करना, और फिर ii) उन बिंदुओं में से अधिकांश को हटाने के लिए एक दूसरे अलग पीडीएमएस स्टैंप का उपयोग करना, डॉट्स21 के अलग-अलग द्वीपों को पीछे छोड़ना। इस मूल विधि के साथ द्वीप बनाने में कठिनाई इस तथ्य से जटिल है कि प्रक्रिया के पहले चरण में लगातार ग्रिड पैटर्न बनाना अपने आप में चुनौतीपूर्ण है। माइक्रोप्रिंटिंग टिकटों परिपत्र microposts, जिसका व्यास वांछित डॉट आकार से मेल खाती है की एक सरणी से बना रहे हैं. इन टिकटों को तब प्रोटीन की एक समान परत के साथ लेपित किया जाता है और फिर वांछित पैटर्न बनाने के लिए उपचारित कवरलिप्स पर दबाव की सटीक मात्रा के साथ मुहर लगाई जाती है। एक तरफ, स्टांप पर बहुत अधिक दबाव डालने से असमान प्रोटीन हस्तांतरण और स्तंभों के बीच स्तंभ बकलिंग या सैगिंग के कारण खराब पैटर्न निष्ठा हो सकती है, जिससे कांच के संपर्क में आ सकता है। दूसरी ओर, बहुत कम दबाव लागू करने के परिणामस्वरूप कोई प्रोटीन हस्तांतरण और खराब पैटर्न निष्ठा नहीं होती है। इन कारणों से, एक स्थानांतरण प्रक्रिया जिसका उपयोग केवल एक चरण में डॉट्स के अलग-अलग द्वीपों के उच्च गुणवत्ता वाले माइक्रोपैटर्न बनाने के लिए किया जा सकता है, वांछित है।
इसमें, एक विधि का वर्णन माइक्रोन-आकार के फ्लोरोसेंट प्रोटीन आसंजन बिंदुओं के द्वीपों के अप्रत्यक्ष माइक्रोपैटर्निंग के लिए एक पीएए जेल पर किया गया है जो पहले से विकसित तरीकों की तुलना में अधिक सुसंगत और बहुमुखी है। जबकि पुराने अप्रत्यक्ष माइक्रोपैटर्निंग विधियां पीडीएमएस स्टैंप से एक मध्यवर्ती सब्सट्रेट में प्रोटीन पैटर्न के हस्तांतरण पर निर्भर करती हैं, यहां पेश की गई विधि प्रोटीन हटाने के लिए एक पोत के रूप में पीडीएमएस टिकटों का उपयोग करती है, इसके अलावा नहीं। यह पहले मौलिक रूप से उपयोग किए जाने वाले पीडीएमएस टिकटों की संरचना को बदलकर किया जाता है। समान रूप से रिक्त परिपत्र स्तंभों के पैटर्न से बने टिकटों को बनाने के बजाय, टिकटें इस विधि में समान रूप से रिक्त परिपत्र छेद के पैटर्न से बनी होती हैं।
इस नई संरचना के साथ, इन पीडीएमएस टिकटों की सतह को तब ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ इलाज किया जा सकता है जैसा कि पहले 20,29,30 वर्णित किया गया था, जिससे टिकट प्रोटीन के साथ सहसंयोजक रूप से बंधन करने में सक्षम हो जाता है। जब फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ समान रूप से लेपित ग्लास कवरस्लिप पर उपयोग किया जाता है, तो इन ग्लूटाराल्डिहाइड-उपचारित पीडीएमएस टिकटों का उपयोग कवरस्लिप की सतह पर अधिकांश प्रोटीन को हटाने के लिए किया जाता है, जिससे स्टैंप पर माइक्रोन-आकार के छेद के स्थान द्वारा पूर्वनिर्धारित डॉट्स के केवल वांछित पैटर्न को पीछे छोड़ दिया जाता है। यह परिवर्तन डॉट्स के निकट-निरंतर ग्रिड से बने पैटर्न उत्पन्न करने और केवल एक चरण के माध्यम से डॉट्स के अलग-अलग द्वीपों को बनाने के लिए सफलता दर को बढ़ाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अप्रत्यक्ष रूप से पीएए हाइड्रोजेल को पैटर्न करने की एक बेहतर विधि इस पेपर में वर्णित है। यह दृष्टिकोण उन विधियों पर बनाता है जिनका उपयोग पिछले 20,35,36,37,38,39,40,41,42 के रूप में किया गया है।<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को सहायक चर्चा और डेटा विश्लेषण के साथ सहायता के लिए मैकेनिकल इंजीनियरिंग के बोस्टन विश्वविद्यालय विभाग से डॉ पॉल बारबोन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस अध्ययन को एनएसएफ अनुदान सीएमएमआई -1910401 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
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