マイクロパターントラクション顕微鏡のパターン生成
Summary
我々は、軟質ヒドロゲル上の細胞外マトリックスタンパク質のドットアレイの単一の減法パターニングステップによるマイクロコンタクト印刷に基づく、細胞牽引力を測定するための標準的な方法の改善を説明する。この方法は、細胞クラスター形状を制御するために不可欠な島パターンのより簡単でより一貫した作製を可能にする。
Abstract
マイクロパターン牽引顕微鏡は、単一細胞および細胞集塊の形状の制御を可能にする。さらに、マイクロメートルの長さスケールでパターニングする能力は、各マイクロパターン化されたドットが、次に柔らかい、下層のヒドロゲルを変形させる単一焦点接着の形成を可能にするので、牽引力の測定のためにこれらのパターン化された接触ゾーンの使用を可能にする。このアプローチは、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、血小板、および上皮細胞を含む広範囲の細胞型に使用されている。
このレビューは、細胞外マトリックスタンパク質を、予め指定されたサイズおよび間隔のドットの規則的な配列でポリアクリルアミドヒドロゲルに印刷することを可能にする技術の進化を説明する。マイクロメートルスケールのパターンは柔らかい基板に直接印刷することは困難であるため、最初に硬いガラスカバースリップ上にパターンが生成され、次いでゲル化中にパターンをヒドロゲルに転写するために使用される。まず、カバースリップ上に小さなドットの配列を生成するためのオリジナルのマイクロコンタクト印刷アプローチについて説明する。パターンの大部分を削除して小さなドットの島を残す 2 番目のステップは、このようなパターン化されたドットの配列上のセルとセル クラスターの形状を制御するために必要です。
次に、単一の減法パターニングステップを使用してドットの島を生成することを可能にするこのアプローチの進化について説明する。このアプローチは、ユーザーにとっては非常に単純化されていますが、パターンの作成に必要なマスターモールドの寿命が短くなるという欠点があります。最後に、変位ドットの画像とその後の細胞生成牽引場の解析のために開発された計算アプローチが説明され、これらの解析パッケージの更新バージョンが提供されます。
Introduction
ほとんどの細胞表現型は、その環境に牽引力を発揮する。これらの牽引力は、アクチンおよびミオシンのネットワークである細胞の収縮性細胞骨格、ならびに他の糸状生体高分子および架橋タンパク質1、2、3、4によって生成される。細胞内で生成された力は、主にインテグリンおよびカドヘリンなどの膜貫通タンパク質を介して、細胞外環境または隣接する細胞に伝達され得る5、6。細胞がどのように広がり、収縮するか、およびそれらの動きに関連する牽引力の大きさは、その環境との親密な会話の結果であり、これは細胞外マトリックス(ECM)7,8に存在するタンパク質の種類と量、およびECMの剛性に大きく依存する。実際、牽引力顕微鏡は、基質の剛性、機械的応力やひずみ、または他の細胞との接触などの局所刺激に対する細胞の応答性を理解するための非常に貴重なツールとなっています。この情報は、癌や喘息などの疾患の理解に直接関連しています9,10,11,12。
既知の材料特性の基板の力誘起変形を測定するために使用できるシステムは、牽引力を計算するために必要とされる。これらの変化は時間の経過とともに追跡する必要があり、イメージング技術と画像処理技術の両方が必要です。細胞牽引力を決定するために使用された最初の方法の1つは、細胞を播種したコラーゲンヒドロゲルの収縮の観察および分析であったが、この方法は半定量的であった13。別の、より洗練された方法は、シリコーン14の薄いシートの変形から生じる力を決定することによって単一細胞によって加えられる牽引力を測定することであった。その後、より定量的な測定技術が開発され、これらの方法はポリアクリルアミド(PAA)12,15,16などの軟質ヒドロゲルの使用も可能になりました。これらの軟質材料を使用する場合、牽引力は、ヒドロゲルに埋め込まれたランダムに変位したビーズの力誘発変位とゲル16、17の機械的特性から決定することができた。別の進歩は、柔らかいポリジメチルシロキサン(PDMS)で作られたマイクロポストアレイの開発とともにもたらされ、それらのたわみを測定し、ビーム理論18を使用して力に変換することができる。
最後に、軟質ヒドロゲルをマイクロパターニングする方法が、これらのアプローチが細胞接着のための接触領域の制御を可能にするように開発された。細胞の接触領域内のマイクロパターンの変形を測定することにより、力のない基準画像を必要としないため、牽引力を容易に計算することができた19。この方法は、細胞牽引力20の測定のためにPAAゲル上にミクロンサイズの離散蛍光タンパク質接着点の規則的な配列の間接的なパターニングを可能にするため、広く採用されている。これらの力を計算するために、ユーザ入力を必要とせずに各マイクロパターンドットの動きを追跡できる画像処理アルゴリズムが開発された21。
この方法は、ドットパターンのグリッド全体を作成するのは簡単ですが、ドットの孤立したパッチ(またはアイランド)のパターンが必要な場合は、より複雑になります。マイクロパターンの島は、細胞のクラスターの形状やある程度の大きさの制御が必要な場合に便利です。これらの島を作成するために、前述のマイクロコンタクト印刷の方法は、2つの異なるステップを必要とする:i)カバースリップ上にドットの忠実度の高いパターンを作成するために1つのPDMSスタンプを使用し、次いでii)2番目の異なるPDMSスタンプを使用してそれらのドットのほとんどを除去し、ドット21の孤立した島を残す。この独自の方法で島を作成する難しさは、プロセスの最初のステップで一貫したグリッドパターンを作成すること自体が困難であるという事実によってさらに悪化します。マイクロプリントスタンプは、円形マイクロポストのアレイで構成され、その直径は所望のドットサイズに対応する。次に、これらのスタンプを均一なタンパク質層でコーティングし、処理されたカバースリップに正確な量の圧力でスタンプして、所望のパターンを作成します。一方では、スタンプに過度の圧力をかけると、ピラー間の座屈やたるみによる不均一なタンパク質転写やパターン忠実度の低下が生じ、ガラスとの接触につながる可能性があります。一方、圧力が少なすぎると、タンパク質の転写がほとんどまたはまったくなく、パターンの忠実度が低下します。これらの理由から、離島状のドットのマイクロパターンを1ステップで一貫して作成できる転写プロセスが望まれている。
本明細書では、以前に開発された方法よりも一貫性があり汎用性の高いPAAゲル上のミクロンサイズの蛍光タンパク質接着点の島の間接的なマイクロパターニングのための方法が記載されている。古い間接マイクロパターニング法は、PDMSスタンプから中間基板へのタンパク質パターンの転写に依存しているのに対し、ここで紹介する方法は、添加ではなくタンパク質除去のための容器として代わりにPDMSスタンプを使用する。これは、まず使用するPDMSスタンプの構造を根本的に変更することによって行われます。この方法では、等間隔の円形の柱のパターンで構成されるスタンプを作成するのではなく、スタンプは等間隔の円形の穴のパターンで構成されています。
この新しい構造により、これらのPDMSスタンプの表面は、前述のようにグルタルアルデヒドで処理することができ、20、29、30、スタンプをタンパク質と共有結合させることができる。蛍光タンパク質で均等にコーティングされたガラスカバースリップに使用する場合、これらのグルタルアルデヒド処理PDMSスタンプは、カバースリップの表面上のタンパク質の大部分を除去するために使用され、スタンプ上のミクロンサイズの穴の位置によって所定のドットの所望のパターンのみを残す。この変更により、ほぼ連続したドットのグリッドで構成されるパターンを生成し、1 つのステップで孤立したドットの島を作成するための成功率が向上します。
Protocol
Representative Results
Discussion
PAAヒドロゲルを間接的にパターニングする改良された方法が、この論文に記載されている。このアプローチは、以前に20,35,36,37,38,39,40,41,42で使用されていた方法に基づいています。<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ボストン大学機械工学科のPaul Barbone博士に、データ分析に関する有益な議論と支援に感謝したい。この研究は、NSF助成金CMMI-1910401によって支援された。
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
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