Geração de Padrões para Microscopia de Tração de Micropattern

Summary

Descrevemos melhorias em um método padrão para medir forças de tração celular, baseado na impressão de microcontatos com uma única etapa de padronização subtrativa de matrizes de pontos de proteínas de matriz extracelular em hidrogéis macios. Este método permite uma fabricação mais simples e consistente dos padrões da ilha, essenciais para controlar a forma do aglomerado celular.

Abstract

Microscopia de tração de micropattern permite o controle da forma de células únicas e aglomerados celulares. Além disso, a capacidade de padronizar na escala de comprimento de micrômetro permite o uso dessas zonas de contato padronizadas para a medição de forças de tração, uma vez que cada ponto micropatterado permite a formação de uma única adesão focal que, em seguida, deforma o hidrogel macio e subjacente. Esta abordagem tem sido usada para uma ampla gama de tipos de células, incluindo células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, plaquetas e células epiteliais.

Esta revisão descreve a evolução de técnicas que permitem a impressão de proteínas de matriz extracelular em hidrugas de poliacrilamida em uma matriz regular de pontos de tamanho e espaçamento pré-especificados. Como padrões de escala de micrômetros são difíceis de imprimir diretamente em substratos macios, os padrões são primeiro gerados em tampas de vidro rígidas que são então usados para transferir o padrão para o hidrogel durante a gelação. Primeiro, descreve-se a abordagem original de impressão de microcontatos para gerar matrizes de pequenos pontos no deslizamento de tampas. Um segundo passo que remove a maior parte do padrão para deixar ilhas de pequenos pontos é necessário para controlar as formas de células e aglomerados celulares em tais matrizes de pontos padronizados.

Em seguida, uma evolução dessa abordagem que permite a geração de ilhas de pontos usando um único passo de padronização subtrativa é descrita. Essa abordagem é muito simplificada para o usuário, mas tem a desvantagem de uma vida útil reduzida para o molde mestre necessário para fazer os padrões. Finalmente, são descritas as abordagens computacionais desenvolvidas para a análise de imagens de pontos deslocados e campos de tração gerados por células subsequentes, e são fornecidas versões atualizadas desses pacotes de análise.

Introduction

A maioria dos fenótipos celulares exercem forças de tração em seu ambiente. Essas forças de tração são geradas pelo citoesqueleto contractil de uma célula, que é uma rede de actina e miosina, e outros biopolímeros filamentosos e proteínas de crosslinking 1,2,3,4. As forças geradas dentro da célula podem ser transmitidas para o ambiente extracelular ou células adjacentes, principalmente através de proteínas transmembranas, como integrins e cadherinas, respectivamente ^5,6. Como uma célula se espalha ou contrai – e as magnitudes das forças de tração associadas a esses movimentos – é o resultado de uma conversa íntima com seu ambiente, que depende em grande parte do tipo e quantidade de proteína presente na matriz extracelular (ECM)^7,8 e da rigidez do ECM. De fato, a microscopia de força de tração tornou-se uma ferramenta inestimável para entender a resposta celular a estímulos locais, como rigidez de substrato, tensões mecânicas impostas e cepas, ou contato com outras células. Essas informações são diretamente relevantes para a compreensão de doenças como câncer e asma 9,10,11,12.

Um sistema que pode ser usado para medir a deformação induzida pela força de um substrato de propriedades materiais conhecidas é necessário para calcular forças de tração. Essas mudanças devem ser acompanhadas ao longo do tempo, exigindo técnicas de imagem e processamento de imagens. Um dos primeiros métodos utilizados para determinar as forças de tração celular foi a observação e análise da contração de hidrogéis de colágeno semeados com células, embora este método fosse apenas semiquantitativo¹³. Outro método mais refinado foi medir as forças de tração exercidas por células únicas, determinando as forças resultantes da deformação de uma fina folha de silicone¹⁴. Posteriormente, foram desenvolvidas técnicas de medição mais quantitativas, e esses métodos também permitiram o uso de hidrogéis macios, como poliacrilamida (PAA)12,15,16. Ao utilizar esses materiais macios, as forças de tração poderiam ser determinadas a partir do deslocamento induzido pela força de contas deslocadas aleatoriamente embutidas no hidrogel e nas propriedades mecânicas do gel^16,17. Outro avanço veio com o desenvolvimento de matrizes de micropostos feitas de polidimimetilsiloxano macio (PDMS) para que sua deflexão pudesse ser medida e convertida em força usando a teoria do feixe¹⁸.

Finalmente, métodos para micropatterning hidrogéis macios foram desenvolvidos à medida que essas abordagens permitem o controle das áreas de contato para adesão celular. Medindo a deformação do micropattern dentro da área de contato de uma célula, as forças de tração poderiam facilmente ser calculadas porque uma imagem de referência livre de força não é necessária¹⁹. Este método tem sido amplamente adotado, pois permite a padronização indireta de uma matriz regular de pontos de adesão de proteína fluorescente do tamanho de mícrons e discretos em géis PAA para a medição das forças de tração celular²⁰. Para calcular essas forças, um algoritmo de processamento de imagem, que pode rastrear os movimentos de cada ponto micropatterado sem exigir a entrada do usuário, foi desenvolvido²¹.

Embora este método seja simples para criar grades inteiras de padrões de pontos, é mais complicado quando padrões de manchas isoladas (ou ilhas) de pontos são desejados. Ilhas micropatteradas são úteis quando o controle da forma, e até certo ponto do tamanho, de aglomerados de células é necessário. Para criar essas ilhas, o método acima mencionado de impressão de microcontatos requer dois passos distintos: i) usar um selo PDMS para criar um padrão de alta fidelidade de pontos em um deslizamento de cobertura, e então ii) usando um segundo selo PDMS diferente para remover a maioria desses pontos, deixando para trás ilhas isoladas de pontos²¹. A dificuldade em criar ilhas com este método original é agravada pelo fato de que fazer padrões de grade consistentes na primeira etapa do processo é desafiador por si só. Os selos de microimpressão são compostos por uma matriz de micropostos circulares, do qual o diâmetro corresponde ao tamanho do ponto desejado. Esses selos são então revestidos com uma camada uniforme de proteína e, em seguida, estampados com uma quantidade precisa de pressão sobre tampas tratadas para criar o padrão desejado. Por um lado, aplicar muita pressão ao carimbo pode resultar em transferência de proteínas irregulares e má fidelidade de padrões devido à fivela de pilares ou flacidez entre pilares, levando ao contato com o vidro. Por outro lado, aplicar pouca pressão resulta em pouca ou nenhuma transferência de proteínas e má fidelidade padrão. Por essas razões, um processo de transferência que pode ser usado para criar consistentemente micropatters de alta qualidade de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo é desejado.

Aqui, um método é descrito para o micropatterning indireto de ilhas de proteína fluorescente do tamanho de mícrons pontos de adesão em um gel PAA que é mais consistente e versátil do que os métodos previamente desenvolvidos. Considerando que os métodos de micropatterning indiretos mais antigos dependem da transferência de padrões proteicos de um selo PDMS para um substrato intermediário, o método introduzido aqui usa selos PDMS em vez disso como um vaso para remoção de proteínas, não adição. Isso é feito primeiro alterando fundamentalmente a estrutura dos selos PDMS utilizados. Em vez de fazer selos compostos de um padrão de pilares circulares espaçados uniformemente, os selos são compostos por um padrão de buracos circulares espaçados uniformemente neste método.

Com esta nova estrutura, a superfície desses selos PDMS pode então ser tratada com glutaraldeído como descrito anteriormente ^20,29,30, tornando o selo capaz de se unir covalentemente com proteína. Quando usados em uma mancha de vidro revestida uniformemente com proteína fluorescente, esses selos PDMS tratados com glutaraldeído são usados para remover a maior parte da proteína na superfície do deslizamento de cobertura, deixando para trás apenas o padrão desejado de pontos pré-determinados pela localização de orifícios do tamanho de mícrons no selo. Essa mudança aumenta a taxa de sucesso para gerar padrões compostos por uma grade quase contínua de pontos e para a criação de ilhas isoladas de pontos em apenas um passo.

Protocol

1. Criação de mestres do silicone NOTA: A maior parte do processo de concepção, criação e solução de problemas dos mestres do silício para a repetida moldagem dos selos PDMS foi coberta anteriormente21, de modo que apenas diferenças fundamentais nesta nova abordagem serão descritas aqui. Crie o design para a máscara fotográfica usando AutoCAD ou software de design similar. Cubra um lado da máscara fotográfica, um fino pedaço de…

Representative Results

Os hidrogéis PAA com o módulo young de E = 3,6 kPa e a razão de Poisson de ν = 0,445 foram feitos para uso por este método de micropatterning subtrativo. Os hidrogéis foram feitos para ter ~100 μm de espessura, o que permite que eles sejam imagens com a configuração de imagem usada aqui, ao mesmo tempo em que impedem que as células desenham o deslizamento rígido abaixo do gel, o que causaria problemas em estudos focados na rigidez celular dessensibilizando23,33</s…

Discussion

Um método aprimorado de padronização indireta de hidrogéis PAA é descrito neste artigo. Essa abordagem baseia-se em métodos que já foram utilizados anteriormente 20,35,36,37,38,39,40,41,42. A principal mudança é q…

Materials

(3-aminopropyl)trimethoxysilane	Sigma Aldrich	#281778
1.5 mL Microcentrifuge tube	Fisher Scientific	#05-408-129
15 mL conical tube	Fisher Scientific	#05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask	Advance Reproductions Corporation	N/A	Custom-designed mask
6 Well Plates	Fisher Scientific	#07-200-83
Acetone	Fisher Scientific	#A18P-4
Acrylamide Solution, 40%	Sigma Aldrich	#A4058
AlexaFluor 488	Thermo Fisher	#A20000
Aminonium Persulfate	Fisher Scientific	#BP179-25
Bisacrylamide	Fisher Scientific	#PR-V3141
Ethanol	Greenfield Global	#111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round	Fisher Scientifc	#12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round	Warner	#64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera	Hamamatsu	#C10600-10B
Human Plasma	Valley Biomedical	#HP1051P	Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N	Millipore Sigma	#1.09057
ImageJ	Wayne Rasband	#1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set	Bioptechs	#190310-35
Kim Wipes	Fisher Scientific	#06-666-11C
Mask Alinger	Karl Suss	#MA6
Matlab 2021	Mathworks	#R2021a
MetaMorph Basic	Molecular Devices	#v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester	Sigma Aldrich	#130672-5G
NucBlue Live Cell Stain	Thermo Fisher	#R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope	Olympus	#IX81
PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	#52-1308-00
Photoresist Spinner Hood	Headway Research	#PWM32
Plasma Cleaner	Harrick	#PDC-001
Plasma Etcher	TePla	#M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source	Prior Scientific	#L200
Silicon Wafers, 100 mm	University Wafer	#809
SU-8 2005	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9463827
SU-8 Developer	Kayaku Advanced Materials Inc.	#NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer	Essex Brownell	#DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine	Fisher Scientific	#BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane	Sigma Aldrich	#448931
UAPON-40XW340 Objective	Olympus	#N2709300
UV Flood Exposure	Newport	#69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm	Ted Pella, Inc.	#19395-40