Генерация паттернов для микрошаговой тракционной микроскопии
Summary
Описаны усовершенствования стандартного метода измерения клеточных тяговых сил, основанного на микроконтактной печати с одной стадией субтрактивного паттерна точечных массивов белков внеклеточного матрикса на мягких гидрогелях. Этот метод позволяет упростить и более последовательное изготовление островных узоров, необходимых для контроля формы клеточного кластера.
Abstract
Микроструктурная тракционная микроскопия позволяет контролировать форму отдельных клеток и клеточных кластеров. Кроме того, способность формировать рисунок на микрометровой шкале длины позволяет использовать эти узорчатые контактные зоны для измерения тяговых сил, поскольку каждая микроструктурированная точка позволяет формировать единую фокальную адгезию, которая затем деформирует мягкий, лежащий в основе гидрогель. Этот подход был использован для широкого спектра типов клеток, включая эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки, фибробласты, тромбоциты и эпителиальные клетки.
В этом обзоре описывается эволюция методов, которые позволяют печатать белки внеклеточного матрикса на полиакриламидных гидрогелях в регулярном массиве точек заранее определенного размера и интервала. Поскольку микрометровые узоры трудно непосредственно напечатать на мягких подложках, узоры сначала генерируются на жестких стеклянных крышках, которые затем используются для переноса рисунка на гидрогель во время гелеобразования. Во-первых, описан оригинальный подход микроконтактной печати для генерации массивов мелких точек на обложке. Второй шаг, который удаляет большую часть узора, чтобы оставить островки маленьких точек, необходим для управления формами клеток и клеточных кластеров на таких массивах узорчатых точек.
Далее описывается эволюция этого подхода, позволяющая генерировать островки точек с помощью одного стадии субтрактивного паттерна. Этот подход значительно упрощен для пользователя, но имеет недостаток в уменьшенном сроке службы для мастер-формы, необходимой для изготовления узоров. Наконец, описаны вычислительные подходы, которые были разработаны для анализа изображений смещенных точек и последующих клеточных тяговых полей, и предоставлены обновленные версии этих пакетов анализа.
Introduction
Большинство клеточных фенотипов оказывают тяговые силы на окружающую среду. Эти тяговые силы генерируются сократительным цитоскелетом клетки, который представляет собой сеть актина и миозина, а также другими нитевидными биополимерами и сшивающими белками 1,2,3,4. Силы, генерируемые внутри клетки, могут передаваться во внеклеточную среду или соседние клетки, главным образом через трансмембранные белки, такие как интегрины и кадгерины, соответственно 5,6. То, как клетка распространяется или сжимается, и величины тяговых сил, связанных с этими движениями, является результатом тесного разговора с окружающей средой, который во многом зависит от типа и количества белка, присутствующего во внеклеточном матриксе (ECM)7,8 и жесткости ECM. Действительно, тракционная микроскопия стала бесценным инструментом для понимания реакции клеток на локальные раздражители, такие как жесткость субстрата, наложенные механические напряжения и деформации или контакт с другими клетками. Эта информация имеет непосредственное отношение к пониманию таких заболеваний, как рак и астма 9,10,11,12.
Система, которая может быть использована для измерения вызванной силой деформации подложки с известными свойствами материала, необходима для расчета тяговых сил. Эти изменения должны отслеживаться с течением времени, требуя как визуализации, так и методов обработки изображений. Одним из первых методов, используемых для определения клеточных тяговых сил, было наблюдение и анализ сокращения коллагеновых гидрогелей, засеянных клетками, хотя этот метод был только полуколичественным13. Другой, более совершенный метод заключался в измерении тяговых сил, оказываемых одиночными ячейками, путем определения сил, возникающих в результате деформации тонкого листа силикона14. Позже были разработаны более количественные методы измерения, и эти методы также позволили использовать мягкие гидрогели, такие как полиакриламид (PAA)12,15,16. При использовании этих мягких материалов тяговые силы могут быть определены по вызванному силой смещению случайно смещенных шариков, встроенных в гидрогель, и механическим свойствамгеля 16,17. Еще одним достижением стала разработка микропостовых массивов из мягкого полидиметилсилоксана (PDMS), чтобы их отклонение можно было измерить и преобразовать в силу с использованием теории пучка18.
Наконец, были разработаны методы микроструктурирования мягких гидрогелей, поскольку эти подходы позволяют контролировать контактные зоны для клеточной адгезии. Измеряя деформацию микрошаблона в области контакта ячейки, можно легко рассчитать силы тяги, поскольку не требуется безсиловое опорное изображение19. Этот метод получил широкое распространение, поскольку он позволяет косвенно моделировать регулярный массив дискретных флуоресцентных точек адгезии белка микронного размера на гелях PAA для измерения клеточных тяговых сил20. Для расчета этих сил был разработан алгоритм обработки изображений, который может отслеживать движения каждой микроструктурированной точки, не требуя ввода данных пользователем21.
Хотя этот метод прост для создания целых сеток точечных узоров, он более сложен, когда требуются узоры изолированных участков (или островков) точек. Микроструктурированные острова полезны, когда необходим контроль формы и в некоторой степени размера кластеров клеток. Для создания этих островов вышеупомянутый метод микроконтактной печати требует двух отдельных этапов: i) использование одного штампа PDMS для создания высокоточного рисунка точек на обложке, а затем ii) использование второго другого штампа PDMS для удаления большинства этих точек, оставляя после себя изолированные островкиточек 21. Сложность создания островов с помощью этого оригинального метода усугубляется тем фактом, что создание последовательных шаблонов сетки на первом этапе процесса само по себе является сложной задачей. Микропечатные штампы состоят из массива круглых микропостов, диаметр которых соответствует желаемому размеру точки. Эти штампы затем покрываются ровным слоем белка, а затем штампуются с точным давлением на обработанные крышки для создания желаемого рисунка. С одной стороны, слишком большое давление на штамп может привести к неравномерному переносу белка и плохой точности рисунка из-за изгиба или провисания между столбами, что приводит к контакту со стеклом. С другой стороны, применение слишком малого давления приводит к незначительному или нулевому переносу белка и плохой точности рисунка. По этим причинам желателен процесс переноса, который может быть использован для последовательного создания высококачественных микроструктур изолированных островков точек всего за один шаг.
В настоящем описан способ непрямого микроструктурирования островков флуоресцентных точек адгезии белка микронного размера на геле PAA, который является более последовательным и универсальным, чем ранее разработанные способы. В то время как более старые методы косвенного микроструктурирования полагаются на перенос белковых паттернов от штампа PDMS к промежуточному субстрату, метод, представленный здесь, использует штампы PDMS вместо этого в качестве сосуда для удаления белка, а не для добавления. Это делается путем сначала фундаментального изменения структуры используемых марок PDMS. Вместо того, чтобы делать штампы, которые состоят из узора из равномерно расположенных круглых столбов, штампы состоят из шаблона равномерно расположенных круглых отверстий в этом методе.
С этой новой структурой поверхность этих штампов PDMS затем может быть обработана глутаровым альдегидом, как описано ранее 20,29,30, что делает штамп способным ковалентно связываться с белком. При использовании на стеклянной крышке, равномерно покрытой флуоресцентным белком, эти обработанные глутаральдегидом штампы PDMS используются для удаления большей части белка на поверхности покровного листа, оставляя после себя только желаемый рисунок точек, предопределенный расположением отверстий микронного размера на штампе. Это изменение увеличивает успешность генерации шаблонов, состоящих из почти непрерывной сетки точек, и для создания изолированных островков точек всего за один шаг.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной работе описан усовершенствованный метод косвенного моделирования гидрогелей ПАА. Этот подход основан на методах, которые использовались ранее 20,35,36,37,38,39,40,41,42.<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Пола Барбоуна с факультета машиностроения Бостонского университета за полезные обсуждения и помощь в анализе данных. Это исследование было поддержано грантом NSF CMMI-1910401.
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
Referências
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
- Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
- Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
- Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
- Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
- Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
- Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
- Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
- . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
- Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
- Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
- Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
- Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
- Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
- Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
- Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
- Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
- Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
- Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
- Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
- Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
- Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
- Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).
