Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma
Summary
Yumuşak hidrojeller üzerindeki hücre dışı matris proteinlerinin nokta dizilerinin tek bir çıkarma modelleme adımıyla mikrotemaslı baskıya dayanan hücresel çekiş kuvvetlerini ölçmek için standart bir yöntemdeki iyileştirmeleri açıklıyoruz. Bu yöntem, hücre kümesi şeklini kontrol etmek için gerekli olan ada desenlerinin daha basit ve daha tutarlı bir şekilde üretilmesini sağlar.
Abstract
Mikrodesen traksiyon mikroskobu, tek hücrelerin ve hücre kümelerinin şeklinin kontrol edilmesini sağlar. Ayrıca, mikrometre uzunluk ölçeğinde modelleme yeteneği, çekiş kuvvetlerinin ölçümü için bu desenli temas bölgelerinin kullanılmasına izin verir, çünkü her mikro desenli nokta, daha sonra yumuşak, altta yatan hidrojeli deforme eden tek bir odak yapışmasının oluşumuna izin verir. Bu yaklaşım, endotel hücreleri, düz kas hücreleri, fibroblastlar, trombositler ve epitel hücreleri dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tipleri için kullanılmıştır.
Bu derlemede, hücre dışı matriks proteinlerinin poliakrilamid hidrojeller üzerine önceden belirlenmiş büyüklük ve aralıktaki düzenli bir dizi nokta dizisinde basılmasına izin veren tekniklerin evrimi açıklanmaktadır. Mikrometre ölçekli desenlerin yumuşak yüzeylere doğrudan basılması zor olduğundan, desenler önce sert cam kapaklarda üretilir ve daha sonra jelasyon sırasında deseni hidrojele aktarmak için kullanılır. İlk olarak, kapak kapağı üzerinde küçük noktalardan oluşan diziler oluşturmak için orijinal mikrotemaslı baskı yaklaşımı açıklanmaktadır. Küçük noktalardan oluşan adalar bırakmak için desenin çoğunu kaldıran ikinci bir adım, bu tür desenli nokta dizileri üzerindeki hücrelerin ve hücre kümelerinin şekillerini denetlemek için gereklidir.
Daha sonra, tek bir çıkarma modelleme adımı kullanarak nokta adalarının oluşturulmasına izin veren bu yaklaşımın bir evrimi açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, kullanıcı için büyük ölçüde basitleştirilmiştir, ancak desenleri yapmak için gereken ana kalıp için azalan bir kullanım ömrünün dezavantajına sahiptir. Son olarak, yer değiştirmiş noktaların ve ardından hücre tarafından oluşturulan çekiş alanlarının görüntülerinin analizi için geliştirilen hesaplama yaklaşımları açıklanmış ve bu analiz paketlerinin güncellenmiş versiyonları sunulmuştur.
Introduction
Çoğu hücre fenotipi, çevrelerine çekiş kuvvetleri uygular. Bu çekiş kuvvetleri, bir aktin ve miyozin ağı olan bir hücrenin kontraktil sitoiskeleti ve diğer filamentli biyopolimerler ve çapraz bağlanan proteinler 1,2,3,4 tarafından üretilir. Hücre içinde üretilen kuvvetler, hücre dışı ortama veya bitişik hücrelere, öncelikle integrinler ve kadherinler gibi transmembran proteinleri aracılığıyla, sırasıyla 5,6 yoluyla iletilebilir. Bir hücrenin nasıl yayıldığı veya büzüldüğü – ve bu hareketlerle ilişkili çekiş kuvvetlerinin büyüklükleri – büyük ölçüde hücre dışı matriste (ECM) 7,8 bulunan proteinin türüne ve miktarına ve ECM’nin sertliğine bağlı olan çevresi ile samimi bir konuşmanın sonucudur. Gerçekten de, çekiş kuvveti mikroskobu, substrat sertliği, uygulanan mekanik gerilmeler ve suşlar veya diğer hücrelerle temas gibi yerel uyaranlara hücre tepkisini anlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Bu bilgiler kanser ve astım gibi hastalıkların anlaşılması ile doğrudan ilgilidir 9,10,11,12.
Çekiş kuvvetlerini hesaplamak için bilinen malzeme özelliklerine sahip bir substratın kuvvet kaynaklı deformasyonunu ölçmek için kullanılabilecek bir sistem gereklidir. Bu değişiklikler zaman içinde izlenmeli ve hem görüntüleme hem de görüntü işleme teknikleri gerektirmelidir. Hücresel çekiş kuvvetlerini belirlemek için kullanılan ilk yöntemlerden biri, hücrelerle tohumlanan kollajen hidrojellerinin kasılmasının gözlemlenmesi ve analiziydi, ancak bu yöntem sadece yarı kantitatif13 idi. Bir başka, daha rafine yöntem, ince bir silikon levha14’ün deformasyonundan kaynaklanan kuvvetleri belirleyerek tek hücreler tarafından uygulanan çekiş kuvvetlerini ölçmekti. Daha sonra, daha nicel ölçüm teknikleri geliştirildi ve bu yöntemler poliakrilamid (PAA) 12,15,16 gibi yumuşak hidrojellerin kullanılmasına da izin verdi. Bu yumuşak malzemeler kullanılırken, çekiş kuvvetleri, hidrojele gömülü rastgele yer değiştirmiş boncukların kuvvet kaynaklı yer değiştirmesinden ve jel16,17’nin mekanik özelliklerinden belirlenebilir. Başka bir gelişme, yumuşak polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış mikropost dizilerinin geliştirilmesiyle geldi, böylece sapmaları ışın teorisi18 kullanılarak ölçülebilir ve kuvvete dönüştürülebilirdi.
Son olarak, yumuşak hidrojellerin mikrodesenlenmesi için yöntemler geliştirilmiştir, çünkü bu yaklaşımlar hücre yapışması için temas alanlarının kontrolüne izin verir. Bir hücrenin temas alanındaki mikro modelin deformasyonunu ölçerek, çekiş kuvvetleri kolayca hesaplanabilir, çünkü kuvvetsiz bir referans görüntüsü gerekli değildir19. Bu yöntem, hücresel çekiş kuvvetlerinin ölçümü için PAA jelleri üzerine düzenli bir mikron boyutunda, ayrık floresan protein yapışma noktaları dizisinin dolaylı olarak modellenmesine izin verdiği için yaygın olarak benimsenmiştir20. Bu kuvvetleri hesaplamak için, kullanıcı girdisi gerektirmeden her bir mikro desenli noktanın hareketlerini izleyebilen bir görüntü işleme algoritması geliştirilmiştir21.
Bu yöntem, nokta desenlerinin tüm ızgaralarını oluşturmak için basit olsa da, izole edilmiş nokta yamalarının (veya adalarının) desenleri istendiğinde daha karmaşıktır. Mikro desenli adalar, hücre kümelerinin şeklinin ve bir dereceye kadar boyutunun kontrolüne ihtiyaç duyulduğunda kullanışlıdır. Bu adaları oluşturmak için, yukarıda bahsedilen mikrotemaslı baskı yöntemi iki ayrı adım gerektirir: i) bir kapak kapağı üzerinde yüksek doğrulukta bir nokta deseni oluşturmak için bir PDMS damgası kullanmak ve daha sonra ii) bu noktaların çoğunu kaldırmak için ikinci bir farklı PDMS damgası kullanmak, geride izole edilmiş noktaadaları 21. Bu orijinal yöntemle adalar yaratmanın zorluğu, sürecin ilk adımında tutarlı ızgara desenleri yapmanın kendi başına zor olduğu gerçeğiyle birleşmektedir. Mikro baskı pulları, çapı istenen nokta boyutuna karşılık gelen bir dizi dairesel mikro direkten oluşur. Bu pullar daha sonra eşit bir protein tabakası ile kaplanır ve daha sonra istenen deseni oluşturmak için işlenmiş kapak fişleri üzerine kesin bir basınç miktarıyla damgalanır. Bir yandan, damgaya çok fazla baskı uygulamak, sütunlar arasında sütun burkulması veya sarkması nedeniyle düzensiz protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olabilir ve bu da camla temasa neden olabilir. Öte yandan, çok az basınç uygulamak, çok az protein transferine veya hiç protein transferine ve zayıf desen doğruluğuna neden olur. Bu nedenlerden dolayı, sadece bir adımda izole edilmiş nokta adalarının yüksek kaliteli mikro desenlerini tutarlı bir şekilde oluşturmak için kullanılabilecek bir transfer işlemi istenmektedir.
Burada, mikron büyüklüğündeki floresan protein yapışma noktalarının adalarının, daha önce geliştirilen yöntemlerden daha tutarlı ve çok yönlü olan bir PAA jeli üzerine dolaylı olarak mikrodesenlenmesi için bir yöntem tanımlanmıştır. Eski dolaylı mikrodesenleme yöntemleri, protein kalıplarının bir PDMS damgasından bir ara substrata aktarılmasına dayanırken, burada tanıtılan yöntem, PDMS damgalarını protein giderimi için bir kap olarak kullanır, toplama değil. Bu, önce kullanılan PDMS damgalarının yapısını temelden değiştirerek yapılır. Eşit aralıklı dairesel sütunlardan oluşan bir desenden oluşan pullar yapmak yerine, pullar bu yöntemde eşit aralıklı dairesel deliklerden oluşan bir desenden oluşur.
Bu yeni yapı ile, bu PDMS damgalarının yüzeyi daha sonra daha önce tarif edildiği gibi glutaraldehit ile muamele edilebilir 20,29,30, böylece damga protein ile kovalent olarak bağlanabilir. Floresan proteini ile eşit şekilde kaplanmış bir cam kapak kapağında kullanıldığında, bu glutaraldehit ile muamele edilmiş PDMS damgaları, kapak kaymasının yüzeyindeki proteinin çoğunu çıkarmak için kullanılır ve geride sadece damga üzerindeki mikron büyüklüğündeki deliklerin yeri tarafından önceden belirlenmiş istenen nokta desenini bırakır. Bu değişiklik, neredeyse sürekli bir nokta ızgarasından oluşan desenler oluşturmak ve yalnızca bir adımla izole edilmiş nokta adaları oluşturmak için başarı oranını artırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda PAA hidrojellerinin dolaylı olarak modellenmesi için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, daha önce 20,35,36,37,38,39,40,41,42 numaralı yönteme dayanmaktadır. Birincil değişikli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Boston Üniversitesi Makine Mühendisliği Bölümü’nden Dr. Paul Barbone’a yararlı tartışmalar ve veri analizi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma NSF hibesi CMMI-1910401 ile desteklenmiştir.
Materials
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
Referências
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
- Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
- Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
- Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
- Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , 11-22 (2011).
- Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
- Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
- Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
- Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
- Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
- Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
- Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), 041923 (2008).
- . Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249 Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007)
- Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
- Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
- Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
- Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
- Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
- Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
- Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
- Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
- Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
- Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
- Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
- Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
- Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
- Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
- Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
- Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
- Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
- Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).
