A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.
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Artigo de método
Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia
Neste artigo
Resumo
Resumo
Imunidade herdada descreve como alguns animais podem passar a "memória" de uma infecção anterior para seus filhos. Isso pode aumentar a resistência ao patógeno em sua descendência e promover a sobrevivência. Embora a imunidade herdada tenha sido relatada em muitos invertebrados, os mecanismos subjacentes a este fenômeno epigenético são amplamente desconhecidos. A infecção de Caenorhabditis elegans pelo patógeno microsporidiano natural Nematocida parisii resulta nos vermes que produzem descendentes que são robustamente resistentes à microsporidia. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade intergeracional no modelo de infecção n . parisii -C. elegans simples e geneticamente tratável. O artigo atual descreve métodos para infectar C. elegans e gerar descendentes imuno-primed. Métodos também são dados para avaliar a resistência à infecção por microsporidia, por meio da coloração de microsporidia e da visualização da infecção por microscopia. Em particular, a imunidade herdada impede a invasão de células hospedeiras por microsporidia, e a fluorescência na hibridização in situ (FISH) pode ser usada para quantificar eventos de invasão. A quantidade relativa de esporos de microsporidia produzidos na prole imuno-primed pode ser quantificada pela coloração dos esporos com um corante de ligação de quitina. Até o momento, esses métodos lançaram luz sobre a cinética e a especificidade do patógeno da imunidade herdada, bem como os mecanismos moleculares que a subjacente. Essas técnicas, ao lado das extensas ferramentas disponíveis para a pesquisa de C. elegans , permitirão importantes descobertas no campo da imunidade herdada.
Introdução
A imunidade herdada é um fenômeno epigenético pelo qual a exposição dos pais a patógenos pode permitir a produção de descendentes resistentes a infecções. Esse tipo de memória imunológica tem sido mostrado em muitos invertebrados que não possuem sistemas imunológicos adaptativos e podem proteger contra doenças virais, bacterianas e fúngicas1. Embora a imunidade herdada tenha implicações importantes para entender a saúde e a evolução, os mecanismos moleculares subjacentes a essa proteção são amplamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque muitos dos animais em que a imunidade herdada foi descrita não são organismos modelo estabelecidos par....
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Protocolo
O presente estudo utiliza o tipo selvagem C. elegans Bristol strain N2 cultivado a 21 °C.
1. Preparação de mídia
- Prepare a mídia M9 conforme relatório anterior 21,22.
- Prepare o meio de crescimento do nematoide (GNM) conforme relatório anterior21,22. Despeje 12 mL de NGM por placa de 6 cm ou 30 mL por placa de 10 cm.
- Prepare a cepa Escherichia coli OP50-1 conforme um relatório anterior23.
- Prepare placas de NGM op50-1 semeadas se....
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Resultados
No presente estudo, as populações parentais de C. elegans (P0) foram infectadas na fase L1 com uma baixa dose de esporos N. parisii . Essas condições de infecção são tipicamente usadas para obter um alto número de progêneres f1 resistentes a microsporídia através do branqueamento dos pais. Populações parentais infectadas e controles não infectados foram fixados em 72 hpi e manchados com DY96 para visualizar os embriões de vermes e esporos de microsporidia (Figura 1A). Anima.......
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Discussão
O presente protocolo descreve o estudo da microsporidia e da imunidade herdada em um modelo de infecção n. parisii-C. elegans simples e geneticamente tratável.
A preparação do esporo é um protocolo intensivo que normalmente produz esporos suficientes para 6 meses de experimentos, dependendo da produtividade24. É importante ressaltar que a infectividade deve ser determinada para cada novo esporo "lote" antes de usá-lo para os experimentos. Devido à vari.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos a Winnie Zhao e Yin Chen Wan por fornecer comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant #522691522691).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Grânulos de zircônia de 2,0 mm | Biospec Products Inc. | Seringa 11079124ZX | |
| 10 mL | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μ filtro m | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 Microscópio | Zeiss-Fluorescente | para imagens de vermes corados com DY96- e FISH- em lâminas de microscópio | |
| Microscópio de zoom estéreo de fluorescência Axio Zoom V.16 | Zeiss-Para | imagens ao vivo de animais transgênicos fluorescentes para visualizar o IPR | |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Disruptor de contas, Disruptor Analógico Genie SI-D238 Disruptor de Células Genie, lâmina de 120 V | Global | Industrial | |
| Cell-VU, Citômetros Descartáveis de Contagem de Espermatozóides Fisher | Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Meio de Montagem com DAPI | Biotium | 23001 | |
| Meio de montagem EverBrite sem software DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ | Rotor | ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Usado para girar tubos de embriões branqueados para incubação durante a noite | |
| Sonda MicroB FISH Biosearch | Technologies Inc. | - | Sintetizado com uma modificação Quasar 570 (Cy3) 5' e HPLC purificado, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Tipo selvagem, cepa Bristol | Cepa padrão | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Solução de hidróxido de sódio (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Solução de hipoclorito de sódio (6% ) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Microscópio Estéreo | Zeiss-Para | manutenção diária de vermes e contagem de vermes L1 para configurações de ensaio | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
Referências
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
- Au, V., et al.
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Reimpressões e permissões
