Het protocol beschrijft hier de meting van de ruimtelijke organisatie van de visuele assen van huisvliegogen, in kaart gebracht door een automatisch apparaat, met behulp van het pseudopupil-fenomeen en het pupilmechanisme van de fotoreceptorcellen.
Dit artikel beschrijft de automatische meting van de ruimtelijke organisatie van de visuele assen van insecten samengestelde ogen, die bestaan uit enkele duizenden visuele eenheden genaamd ommatidia. Elk ommatidium bemonstert de optische informatie vanuit een kleine vaste hoek, met een geschatte Gaussisch verdeelde gevoeligheid (halve breedte in de orde van 1°) gecentreerd rond een visuele as. Samen verzamelen de ommatidia de visuele informatie uit een bijna panoramisch gezichtsveld. De ruimtelijke verdeling van de visuele assen bepaalt dus de ruimtelijke resolutie van het oog. Kennis van de optische organisatie van een samengesteld oog en zijn gezichtsscherpte is cruciaal voor kwantitatieve studies van neurale verwerking van de visuele informatie. Hier presenteren we een geautomatiseerde procedure voor het in kaart brengen van de visuele assen van een samengesteld oog, met behulp van een intrinsiek, in vivo optisch fenomeen, de pseudopupil en het pupilmechanisme van de fotoreceptorcellen. We schetsen de optomechanische opstelling voor het scannen van insectenogen en gebruiken experimentele resultaten verkregen van een huisvlieg, Musca domestica, om de stappen in de meetprocedure te illustreren.
De compactheid van visuele systemen van insecten en de behendigheid van hun eigenaren, die een sterk ontwikkelde visuele informatieverwerking demonstreren, hebben mensen met zowel wetenschappelijke als niet-wetenschappelijke achtergronden geïntrigeerd. Insectenogen zijn erkend als krachtige optische apparaten die acute en veelzijdige visuele capaciteiten mogelijk maken 1,2. Vliegen staan bijvoorbeeld bekend om hun snelle reacties op bewegende objecten, en bijen staan bekend om het bezitten van kleurzicht en polarisatievisie2.
De samengestelde ogen van geleedpotigen bestaan uit talrijke anatomisch vergelijkbare eenheden, de ommatidia, die elk worden afgedekt door een facetlens. Bij Diptera (vliegen) benadert de assemblage van facetlenzen, gezamenlijk bekend als het hoornvlies, vaak een halfrond. Elk ommatidiummonster valt licht in vanuit een kleine vaste hoek met halve breedte in de orde van 1°. De ommatidia van de twee ogen samen bemonsteren ongeveer de volledige vaste hoek, maar de visuele assen van de ommatidia zijn niet gelijkmatig verdeeld. Bepaalde ooggebieden hebben een hoge dichtheid van visuele assen, waardoor een gebied met een hoge ruimtelijke scherpte ontstaat, in de volksmond een fovea genoemd. Het resterende deel van het oog heeft dan een grovere ruimtelijke resolutie 3,4,5,6,7,8,9.
Een kwantitatieve analyse van de optische organisatie van de samengestelde ogen is cruciaal voor gedetailleerde studies van de neurale verwerking van visuele informatie. Studies van de neurale netwerken van de hersenen van een insect10 vereisen vaak kennis van de ruimtelijke verdeling van de ommatidiale assen. Bovendien hebben samengestelde ogen verschillende technische innovaties geïnspireerd. Veel initiatieven om bio-geïnspireerde kunstogen te produceren zijn gebaseerd op bestaande kwantitatieve studies van echte samengestelde ogen 11,12,13. Een op halfgeleiders gebaseerde sensor met een hoge ruimtelijke resolutie is bijvoorbeeld ontworpen op basis van het model van insecten samengestelde ogen 11,14,15,16,17. De tot nu toe ontwikkelde apparaten hebben echter niet de werkelijke kenmerken van bestaande insectenogen geïmplementeerd. Nauwkeurige representaties van insecten samengestelde ogen en hun ruimtelijke organisatie vereisen gedetailleerde en betrouwbare gegevens van natuurlijke ogen, die niet uitgebreid beschikbaar zijn.
De belangrijkste reden voor het gebrek aan gegevens is de extreme saaiheid van de beschikbare procedures voor het in kaart brengen van de ruimtelijke kenmerken van de ogen. Dit heeft geleid tot pogingen om een meer geautomatiseerde eye mapping-procedure op te zetten. In een eerste poging tot geautomatiseerde analyses van insecten samengestelde ogen, ontwikkelden Douglass en Wehling18 een scanprocedure voor het in kaart brengen van facetmaten in het hoornvlies en toonden de haalbaarheid ervan aan voor een paar vliegensoorten. Hier breiden we hun aanpak uit door methoden te ontwikkelen om niet alleen de facetten van het hoornvlies te scannen, maar ook de visuele assen van de ommatidia waartoe de facetten behoren te beoordelen. We presenteren het geval van huisvliegenogen om de betrokken procedures te illustreren.
De experimentele opstelling voor het scannen van insectenogen is: gedeeltelijk optisch, d.w.z. een microscoop met camera en verlichtingsoptiek; gedeeltelijk mechanisch, d.w.z. een goniometersysteem voor het roteren van het onderzochte insect; en gedeeltelijk computationeel, d.w.z. gebruik van softwarestuurprogramma’s voor de instrumenten en programma’s voor het uitvoeren van metingen en analyses. De ontwikkelde methoden omvatten een reeks computationele procedures, van het vastleggen van beelden, het kiezen van camerakanalen en het instellen van beeldverwerkingsdrempels tot het herkennen van individuele facetlocaties via heldere lichtvlekken die worden gereflecteerd door hun bolle oppervlakken. Fouriertransformatiemethoden waren cruciaal in de beeldanalyse, zowel voor het detecteren van individuele facetten als voor het analyseren van de facetpatronen.
Het artikel is als volgt opgebouwd. We introduceren eerst de experimentele opstelling en het pseudopupil-fenomeen – de optische marker die wordt gebruikt om de visuele assen van de fotoreceptoren in levende ogen te identificeren 19,20,21. Vervolgens worden de algoritmen beschreven die worden gebruikt in de scanprocedure en beeldanalyse.
De ruimtelijke verdeling van de visuele assen van huisvliegogen kan in kaart worden gebracht met behulp van het pseudopupil-fenomeen van samengestelde ogen en de reflectieveranderingen veroorzaakt door het lichtafhankelijke pupilmechanisme. Daarom wordt een onderzochte vlieg gemonteerd in een goniometrisch systeem, dat inspectie van het lokale facetpatroon mogelijk maakt met een microscoopopstelling uitgerust met een digitale camera, allemaal onder computerbesturing. Beeldanalyse levert oogkaarten op. Een essentieel prob…
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd financieel ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research/European Office of Aerospace Research and Development AFOSR/EOARD (subsidie FA9550-15-1-0068, aan D.G.S.). We danken Dr. Primož Pirih voor vele nuttige discussies en Kehan Satu, Hein Leertouwer en Oscar Rincón Cardeño voor hulp.
Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |