MicroRNA Küme Ağ Analizi için CRISPR Gen Düzenleme Aracı
Summary
Bu protokol, mikroRNA küme ağ analizi için düzenli aralıklarla aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gen düzenleme iş akışını tanımlayan yüksek verimli bir kümelenmiş ve tek bir deneyde 35 kb kadar büyük benzersiz miRNA kümesi üyesi delesyon kombinasyonları taşıyan genetiği değiştirilmiş hücre hatlarından oluşan bir panelin hızlı bir şekilde üretilmesini sağlar.
Abstract
MikroRNA’lar (miRNA’lar) kanser ve metastazın önemli hücresel düzenleyicileri (tümör baskılayıcılar, pro-onkojenik faktörler) olarak ortaya çıkmıştır. Yayınlanan çalışmaların çoğu, küçük RNA’ların kanserdeki rolünü karakterize ederken tek bir miRNA’ya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30’u, genellikle birlikte eksprese edilen kümelenmiş birimlerde düzenlenmiştir, bu da karmaşık ve koordineli bir kodlamayan RNA düzenleme sistemini gösterir. Kodlanmamış küçük RNA’ları kliniğe çevirmeden önce kümelenmiş miRNA ağlarının tümör büyümesini, kanser saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl çalıştığının daha net bir şekilde belirtilmesi gerekir.
Prostat kanseri bağlamında ~ 35.000 bp uzunluğunda bir lokus içinde bulunan yedi miRNA geninden oluşan genomik bir kümenin onkojenik rolünü incelemek için düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) aracılı gen düzenleme prosedürünün kullanılması, yüksek verimli bir kümelenmiş olarak kullanılmıştır. Bu yaklaşım için, insan kanseri hücre hatları, DOX içeren ortamda 48 saat boyunca yetiştirilen doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir Cas9 nükleaz için bir lentivirüs vektörü ile enfekte edildi. Hücreler daha sonra, tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel veya kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan kanser hücresi hatlarının hızlı bir şekilde üretilmesine izin vermek için genomik bölgeye özgü CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidleri ile komplekslenmiş sentetik trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) ile birlikte transfekte edildi.
Bu yüksek verimli gen düzenleme sisteminin avantajları, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasından kaçınma yeteneği, 24 kuyucuklu bir formatta benzersiz kılavuz RNA kombinasyonları ile hücreleri transfekte etme esnekliği ve ham hücre lizatları kullanarak daha düşük maliyetli PCR genotiplemesidir. Bu kolaylaştırılmış yaklaşımı kullanan çalışmalar, insan hastalığında yer alan karmaşık küçük kodlamayan RNA ağlarının karakterize edilmesine yardımcı olacak ve gelecekteki terapötik tasarımı daha iyi bilgilendirecek olan miRNA kümesi üyeleri arasındaki fonksiyonel fazlalıkları ve sinerjik / antagonistik etkileşimleri ortaya çıkarmayı vaat etmektedir.
Introduction
Kodlamayan RNA’ların insan hastalığına katkısını araştırmak için daha iyi araştırma araçlarına ihtiyaç vardır. MiRNA disregülasyonu, kanser gibi insan bozukluklarında, kanser hastalarının dokularındaki ve vücut sıvılarındaki (örneğin, kan, idrar) bu küçük kodlamayan RNA’ların ekspresyon profillerini kanser olmayanlara, sağlıklı bireylere, mikrodizilerin kullanılmasına, kantitatif gerçek zamanlı PCR’ye (qRT-PCR) ve yeni nesil derin dizileme teknolojilerine karşı karşılaştırırken sıklıkla gözlenir 1,2 . Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu miRNA’ların büyük bir alt kümesini, tümör oluşumunu, hastalık progresyonunu ve ilaç direncini kontrol eden tümör baskılayıcı, onkojenik ve metastaz faktörleri olarak karakterize etmiştir. MiRNA’ların deneysel aşırı ekspresyonu ve / veya downregülasyon / kaybı, hücrede fonksiyonel ve pleiotropik sonuçlara neden olur ve bu kodlamayan RNA’ların koordine ettiği kanserle ilişkili çok çeşitli aktiviteleri yansıtır – büyüme, apoptoz, farklılaşma, kromatin yeniden şekillenmesi, anjiyogenez, mezenkimal epitel (EMT) ve MET geçişleri, metabolizma ve immün yanıt3.
MiRNA’lar tek genler olarak kodlanır veya çekirdekte transkribe edilen ve sitoplazmada lokalize olan biyolojik olarak olgunlaşmış, tek sarmallı ~ 22 nükleotid (nt) miRNA türlerini üretmeden önce kapsamlı bir şekilde işlenen genomik kümelerde bulunur4. Bu küçük RNA’lar etkilerini transkripsiyon sonrası uygularlar ve katalitik RNA kaynaklı susturma kompleksini (RISC) mRNA bölgesine getirmek için mesajcı RNA (mRNA) hedeflerine bağlanan negatif gen düzenleyicileri olarak hareket ederler, bu da mRNA bozulmasına ve / veya protein translasyonunda bir bloğa neden olur. MiRNA’lar, hayvan sistemlerinde kodlamayan RNA’ların son derece bol bir sınıfıdır ve insan genomunda 2.654 olgun miRNA bulunur (miRBaz salınımı 22.1)5. MiRNA’lar tipik olarak mRNA hedeflerine eksik tamamlayıcılık ile ilişkilidir4. Bu nedenle, tek bir miRNA onlarca ila yüzlerce farklı mRNA hedefini düzenleyebilir ve işlevsel olarak çok çeşitli biyolojik yolları etkileyebilir. MiRNA tabanlı mekanizmaların karmaşıklığına katkıda bulunmak için, tek bir mRNA çoklu, farklı miRNA’lar tarafından düzenlenebilir. Bu nedenle, miRNA disregülasyonunun vücudun homeostatik dengesini nasıl bozduğunu ve insan malignitesine nasıl yol açtığını araştırmak zordur.
Yayınlanan çalışmaların çoğu, hastalık olaylarındaki rollerini karakterize ederken tek bir miRNA’ya odaklanmıştır. Bununla birlikte, insan miRNA genlerinin ~% 30’u, genellikle aynı yönde transkripte edilen ve birlikte eksprese edilen, kodlanmamış RNA regülasyonunun koordineli ve karmaşık bir sistemini gösteren kümelenmiş birimler (tipik olarak ~ 10 kilobaz [kb]) halinde organize edilmiştir6. En büyük polisistronik insan miRNA kümesi, 54 miRNA öncülünden oluşan 14q32 kümesidir. İnsan kanserleri ile ilişkili en iyi çalışılmış kümelenmiş miRNA birimlerinden biri, kodlamayan RNA, c13orf25’in intron 3’ünde bulunan miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 ve miR-92-1’den oluşan miR-17-92 polisistronik kümesidir. MiR-17-92 kümesi hematopoetik malignitelerde sıklıkla çoğalır ve solid tümörlerde aşırı eksprese edilir ve hücre döngüsü progresyonunu, apoptozu ve anjiyogenezi teşvik etmede onkojenik roller oluşturmuştur7. Ek olarak, kodlamayan gen Leu2’nin intronunda bulunan tümör baskılayıcı miR-15a ve miR-16-1 kümesi genellikle lösemilerde silinir ve antiapoptotik gen BCL2’yi ve ek hücre döngüsü ilerleme genleri8’i hedefleyerek tümör büyümesini bloke etmek için işlev gören çok çeşitli kanserlerde aşağı regüle edilir. Yüksek dereceli prostat kanseri olan hastalarda miR-888 kümesi yükselir ve insan kromozomu Xq27.3 9,10 üzerinde bulunan yedi miRNA geninden (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, –891b ve -891a) oluşur.
MiR-888 kümesi, HPCX1 lokusu (Kalıtsal Prostat Kanseri, X’e bağlı 1) içinde, kalıtsal prostat kanseri ailesi soyağacı 11,12,13,14,15,29’un bağlantı analizi ile tanımlanan Xq27-2’yi kapsayan haritalardır. Geleneksel miRNA yanlış ekspresyon araçları (miRNA taklitleri ve antisens inhibitörleri) kullanılarak bireysel miR-888 kümelenmiş üyelerinin fonksiyonel karakterizasyonu, bu miRNA’ların prostat tümörü büyümesini ve invazyonunu düzenlemede örtüşen roller oynadığını göstermiştir 9,10. Bununla birlikte, bu deneysel yöntemler, çoklu miR-888 kümelenmiş üyelerinin, doku homeostazını ve kanser ilerlemesini kontrol etmek için kodlamayan bir RNA ağında sinerjik veya antagonistik olarak nasıl hareket ettiğini incelemek için kendilerini kolayca ödünç vermez. Yüksek verimli CRISPR gen düzenleme teknolojisini kullanan bu tarif edilen kolaylaştırılmış protokol, bu bilgi boşluğunu kapatmak için insan kanserleriyle ilişkili miRNA kümelerini (örneğin, miR-888 kümesi) moleküler olarak diseke etmek için modifiye edilmiştir.
Bakteriyel CRISPR ve CRISPR ile ilişkili (cas) genler, bakteriyofajlara karşı adaptif bağışıklığa aracılık eder16. Bu eski prokaryotik gözetim sisteminin keşfi, istenen herhangi bir genomik lokusu kolayca hedeflemek ve hem in vitro hem de in vivo16,17 çok çeşitli hayvan sistemleri ve hücre tipleri içinde DNA dizisi değişiklikleri yapmak için etkili bir bilimsel araç olarak hızla uyarlandı. Bu teknik, insan hastalığı bağlamında miRNA ağlarını sorgulamak için etkili bir yöntem olarak büyük umut vaat ediyor. Bu amaçla, ölümsüzleştirilmiş insan prostat kanseri hücre hatlarında (LNCaP, PC3-ML) insan kromozomu X üzerinde ~ 35 kb’yi kapsayan miR-888 kümesini incelemek için bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, küme üyelerinin kanser ilerleme yollarını nasıl koordine ettiğini sorgulamak için inşa edilmiştir. Bu yaklaşım, herhangi bir miRNA kümesini karakterize etmek için uygulanabilir ve araştırmacıların tüm miRNA kümesi delesyonunu ve bireysel ve kombinasyon miRNA gen kümesi delesyonlarını tek bir deneyde taşıyan insan hücre hatlarını hızla üretmelerini sağlar.
Bu prosedürde, araştırmacının Streptococcus pyogenes CRISPR ile ilişkili endonükleaz Cas9 (csn1) gen ekspresyonunu kurucu DOX ile indüklenebilir promotör TRE3G aracılığıyla kontrol etmesini sağlayan bir doksisiklin (DOX) ile indüklenebilir lentiviral ekspresyon sistemi taşıyan stabil hücre hatları kurulur. Tet-On 3G iki parçalı sistemi, hem Tet-On 3G geninin hem de blastistronic direnç geninin (BlastR) transkripsiyonunu sağlamak için kurucu bir insan uzama faktörü 1 alfa (hEF1alfa) promotörünü içerir. Tet-On 3G transaktivatör proteini sadece DOX varlığında TRE3G promotörüne bağlanır ve sağlam Cas9 transkripsiyonu ile sonuçlanır. DOX’un yokluğunda, bazal Cas9 ifadesi yoktur veya çok azdır. Bu nedenle, araştırmacı, CRISPR gen düzenleme adımları sırasında DOX ile desteklenmiş ortamda yetiştirilen hücrelerde yüksek Cas9 protein üretimini indükleyebilir ve DOX çekilmesi üzerine hızlı CAS9 protein klirensini kontrol edebilir.
Bu protokol aynı zamanda tüm miRNA kümesini çevreleyen bölgeleri, bireysel miRNA saç tokası (premiRNA) bölgelerini ve / veya küme içindeki miRNA genlerinin alt kümelerini hedefleyen sentetik CRISPR RNA (crRNA) oligonükleotidlerinin tasarımını da tanımlar. Tasarlanan her crRNA, benzersiz bir 5′-terminal 20 nt kılavuz dizisi (hedeflenecek genomik ilgi dizisinin tamamlayıcısı), ardından evrensel trans-aktive edici CRISPR RNA (tracrRNA) oligonükleotidleri18 ile baz eşleşmesini sağlayan değişmez bir 22 nt S. pyogenes tekrar dizisi (5′-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3′) içerir. Birlikte, tavlanmış crRNA ve tracrRNA (karışık 1: 1 oranı) bu protokol için kılavuz RNA olarak işlev görür (Şekil 1A). Her deneyde, iki sentetik kılavuz RNA, bakteriyel Cas9 proteinini, çıkarılması hedeflenen miRNA küme bölgesini çevreleyen genomik DNA bölgelerine (5′ ve 3′) ilişkilendirmek ve eşlik etmek için DOX ile indüklenen hücrelere dönüştürülür (Şekil 1B).
Hücre genomunda bir protospacer bitişik motif (PAM) dizisi (vahşi tip S. pyogenes Cas9 için 5′-NGG-3′) bulunmalı ve kılavuz RNA17 tarafından hedeflenen 20 nt DNA dizisinin hemen bitişiğinde bulunmalıdır. PAM dizisi bağlayıcı bir sinyal görevi görür ve endonükleaz Cas9 enziminin katalitik bölgesini hedeflenen genomik DNA bölgesine konumlandırır, daha sonra PAM’ın ~ 3 nt yukarı yönünde bulunan yönlendirilmiş, çift sarmallı (ds) DNA bölünmesine yol açar. Hücrenin DNA onarım makinesi, parçalanmış DNA uçlarını onarır, bu da mükemmel ligasyonla sonuçlanabilir, ancak genellikle homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) meydana gelir ve onarım bölgesinde küçük eklemelere veya silmelere (indels) neden olur. MiRNA’lar genellikle intergenik ve intronik bölgelerde bulunan kodlamayan genler olduğundan, bu indeller istenmeyen saçmalık / yanlış mutasyonlar yaratma riski düşüktür.
Bu deneylerde kılavuz RNA kompleksi için sentetik RNA oligonükleotidleri (tavlanmış crRNA ve tracrRNA, 1: 1 molar oran) kodlayarak, bu gen nakavt stratejisi, zaman alıcı DNA vektör alt klonlamasını önler ve benzersiz kılavuz RNA kombinasyonlarını hücrelere 24 kuyucuklu bir formatta transfekte etmede büyük esneklik sağlar. PCR genotip taraması için ham hücre lizatlarının hazırlanması, pahalı ve zaman alıcı DNA saflaştırma yöntemlerinden de kaçınırken, kolaylaştırılmış tek koloni hücre hattı üretimi ve fenotipik analize izin verir. Gerçekten de, bu yüksek verimli CRISPR gen düzenleme protokolü, kültürlenmiş prostat kanseri hücre hatlarını (LNCaP, PC3-ML) tek bir deneyde 32 benzersiz kılavuz RNA kombinasyonu ile transfekte etmek ve tüm ~ 35 kb miR-888 küme bölgesi için delesyon taşıyan nakavt hatları üretmek için başarıyla kullanılmıştır; miR-743 ve miR-891a ailelerine ait miR-888 küme üyeleri için daha küçük delesyon kombinasyonları; miR-888 kümesi içindeki bireysel miRNA üyeleri için delesyonların yanı sıra. Bunun gibi çalışmalar, kümelenmiş miRNA’ların, miRNA’ları kliniğe terapötik ve tanısal araçlar olarak çevirmeden önce tümör büyümesini, saldırganlığını ve ilaç direncini düzenlemek için işbirliği içinde nasıl işlev gördüğünün daha net bir şekilde belirtilmesini sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu CRISPR gen düzenleme prosedürü, araştırmacının benzersiz miRNA kümesi delesyon kombinasyonlarını taşıyan tüm hücre hatları panelini hızlı bir şekilde oluşturmasını sağlar. Bu protokolde sentetik tracrRNA (1: 1 molar oran) ile tavlanmış 5′ ve 3′ genomik bölgeye özgü crRNA’lardan oluşan sentetik kılavuz RNA’ların transfeksiyonu, zaman alıcı plazmid vektör alt klonlamasını önler ve 24 kuyucuklu bir format kullanarak daha esnek ve yüksek verimli bir deneysel tasarıma izin verir. DOX i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PC3-ML hücre hatları Mark Stearn (Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi) tarafından sağlanmıştır. Justin Toxey PCR genotiplemesine yardımcı oldu. Bu çalışma, AE-K’ya bir Breedan Adams Vakfı Hibesi, bir Ryan Translasyonel Araştırma Fonu ve bir Commonwealth Sağlık Araştırma Kurulu Hibesi (CHRB-274-11-20) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
Referências
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Laurence, J. . Translating MicroRNAs to the Clinic. , 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A., Thiagalingam, S. . Systems Biology of Cancer. , 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs – microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, 154-158 (2008).
- Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
- Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
- Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
- Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
- Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
- Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
- Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
- Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
- Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
- Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- . SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com) Available from: https://www.snapgene.com (2022)
- . Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI) Available from: https://www.ensembl.org (2022)
- Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
- . miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory) Available from: https://www.mirbase.org (2022)
- . Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon) Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022)
- . Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center) Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022)
- Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
- . Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022)
- Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
- Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
- Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Pesquisa do Câncer. 40 (3), 524-534 (1980).
- Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).
