Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.
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Artigo de método
Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna
Neste artigo
Resumo
Resumo
MicroRNAs (miRNAs) surgiram como importantes reguladores celulares (supressores tumorais, fatores pró-oncogênicos) de câncer e metástase. A maioria dos estudos publicados se concentra em um único miRNA ao caracterizar o papel de pequenas RNAs no câncer. No entanto, ~30% dos genes miRNA humanos estão organizados em unidades agrupadas que são muitas vezes co-expressas, indicando um sistema complexo e coordenado de regulação de RNA não codificadora. Uma subescência mais clara de como as redes miRNA agrupadas funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade do câncer e a resistência a medicamentos é necessária antes de traduzir pequenas RNAs não codificadas para a clínica.
O uso de um procedimento de edição de genes mediados regularmente interespaçoados (CRISPR) tem sido empregado para estudar o papel oncogênico de um aglomerado genômico de sete genes miRNA localizados dentro de um lócus de ~35.000 bp no contexto do câncer de próstata. Para esta abordagem, as linhas de células cancerígenas humanas foram infectadas com um vetor de lentivírus para doxycycline (DOX) indutível nuclease Cas9 cultivada em meio contendo DOX por 48 h. As células foram posteriormente co-transinfetadas com nICIR RNA (tracrRNA) sintético transativante (tracrRNA) complexados com oligonucleotídeos de RNA CRISPR (crRNA) específicos do local para permitir a rápida geração de linhas de células cancerosas carregando toda a exclusão do cluster miRNA e exclusões individuais ou combinadas do cluster genético miRNA dentro de um único experimento.
As vantagens deste sistema de edição de genes de alto rendimento são a capacidade de evitar subcloning vetorial de DNA demorado, a flexibilidade na transfectação de células com combinações de RNA guia única em um formato de 24 poços e a genotipagem pcr de menor custo usando lisatos de células brutas. Estudos que utilizam essa abordagem simplificada prometem descobrir redundâncias funcionais e interações sinérgicas/antagônicas entre membros do cluster miRNA, o que ajudará a caracterizar as complexas pequenas redes de RNA não codificadoras envolvidas em doenças humanas e informar melhor o design terapêutico futuro.
Introdução
São necessárias melhores ferramentas de pesquisa para investigar a contribuição de RNAs não codificadoras em doenças humanas. A distritação miRNA é frequentemente observada em distúrbios humanos, como o câncer, ao comparar os perfis de expressão desses pequenos RNAs não codificados nos tecidos e fluidos corporais (por exemplo, sangue, urina) de pacientes com câncer versus não-câncer, indivíduos saudáveis, empregando microarrays, PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e tecnologias de sequenciamento profundo de última geração 1,2 . Trabalhos recentes caracterizaram um grande subconjunto desses miRNAs como su....
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Protocolo
1. Preparação para edição de genes CRISPR e guiar o design do RNA para gerar linhas de células knockout de cluster miRNA
- Crie um arquivo de DNA contendo a sequência genômica completa da região de interesse do cluster miRNA (intergênica, intronic) e pelo menos 1 kB de regiões genômicas circundantes usando um programa de software de anotação de sequência de DNA19.
- Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado para marcar o lócus de cluster miRNA (intergênico, intronic) e cada sequência individual de grampo de cabelo miRNA pertencente ao cluster miRNA, além de notar outros gene....
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Resultados
Este protocolo de exclusão CRISPR de alta produtividade foi empregado com sucesso usando transfecção de linhas de células cancerígenas humanas Indutíveis Cas9 e PC3-ML com guia de oligonucleotídeo sintético RNAs visando o cluster miR-888, que foram estudados no contexto do câncer de próstata. O cluster miR-888 foi inicialmente identificado em uma tela de perfil de expressão como sendo elevado em pacientes com câncer de próstata com doença de alto grau em comparação com pacientes de baixo grau e nã.......
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Discussão
Este procedimento de edição de genes CRISPR permite que o investigador gere rapidamente um painel inteiro de linhas celulares carregando combinações únicas de exclusão de cluster miRNA. A transfecção de RNAs guia sintéticos compostas por crRNAs genômicas de 5' e 3' genômicas com tracrRNA sintética (razão molar 1:1) neste protocolo evita o subcloamento de vetores plasmídeos demorados e permite um design experimental mais flexível e de alto rendimento usando um formato de 24 poços. A geração de linhas celulares que carrega.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Agradecimentos
As linhas de células PC3-ML foram gentilmente fornecidas por Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey ajudou na genotipagem pcr. Este trabalho foi apoiado por um Breedan Adams Foundation Grant, um Ryan Translational Research Fund, e um Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) para a AE-K.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos PCR de 0,2 mL, tampa plana | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| Tubos de Microcentrífuga de 1,5 mL | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| Placa de cultura de tecidos de 24 poços | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagente, genotipagem |
| Placa de cultura de tecidos de 6 poços | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| Placa de cultura de tecidos de 96 poços | Falcon | 08-772-2C | |
| Anticorpo anti-CRISPR-Cas9 de plástico [7A9-3A3], AbCam monoclonal de camundongo | ab191468 | Reagente de Western blot; 160 kDa; diluição 1:200 | |
| Antibiótico-Antimicótico (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue reagente de cultura |
| BLAST mecanismo de busca de nucleotídeos | Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; site: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidina S, Cloridrato, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | reagente CRISPR; Produto químico, estoque de trabalho = 1 mg/mL em água |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Contador de células |
| Tubos criogênicos | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; site: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Reagente de transfecção; Linhagens celulares LNCaP e PC3-ML |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Fisher | BP231100 | Reagente de cultura Tisuue |
| Meio DMEM com L-Glutamina, 4,5g/L Glicose e Piruvato de Sódio | Corning | MT10013CV | Reagente de cultura Tisuue; Mídia para células PC3-ML |
| Cloridrato de doxiciclina, solução pronta | Reagente CRISPR Sigma-Aldrich | D3072-1ML | Químico, estoque de trabalho = 1 mg/mL de estoque em água |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Gibco | 14190144 | Tisuue reagente de cultura |
| Edit-R CRISPR-Cas9 TracrRNA sintético, 20 nmol, projetado | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | Reagente CRISPR; Oligonucleotídeos tracrRNA universais |
| Edit-R Modificado crRNA sintético, dessalinizado/desprotegido, 2 nmol | Dharmacon, Inc. | reagente crRNA-460XXX | CRISPR; Projetado crRNA oligonucleotídeos |
| EditR Partículas de nuclease lentivirais induzíveis hEF1aBlastCas9, 50 μ L, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | reagente CRISPR; Lenti-iCas9; Sistema vetorial lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 induzível por doxiciclina |
| Visualizador genômico Ensembl | NA | Freeware; site: [ensembl.org] Use: Navegador de genoma para identificar um nucleotídeo que contenha o cluster de miRNA e sequências genealógicas/regulatórias circundantes. | |
| GAPDH Anticorpo (FL-335), coelho policlonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Reagente Western blot; 37 kDa; diluição 1:500 |
| Gel/PCR Kit de extração de fragmentos de DNA | IBI Scientific | IB47010 | Reagente de eletroforese em gel de ácido nucleico |
| Soro bovino fetal Gibco, reagente de cultura certificado | Gibco | 16000044 | Tisuue |
| Brometo de hexadimetrina | MilliporeSigma | Reagente H9268 | CRISPR; Produto químico, estoque de trabalho = 0,8 mg/mL |
| Membrana Immobilon-FL PVDF | MilliporeSigma | IPFL10100 | Reagente de Western blot; tampão de bloqueio de interceptação de nitrocelulose |
| (TBS) | LI-COR | 927-60001 | Reagente de Western blot |
| IRDye 680RD Anticorpo secundário de IgG de cabra anti-rato | LI-COR | 926-68070 | Reagente de Western blot |
| IRDye 800CW Anticorpo secundário de IgG de cabra anti-coelho | LI-COR | 926-32211 | de reagente Western blot |
| Eppendorf | 5425 R | Plasticware | |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; site: [mirbase.org] Uso: Borowser lista todos os grampos de cabelo de miRNA anotados, sequências de miRNA maduras e mapeamento de miRNAs agrupados associados dentro de 10 kb. |
| NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, | Reagente Invitrogen | de | Western blot |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | ; Imagem de Western blot |
| Opti-MEM Soro Reduzido Meio | Gibco | 31985062 | Reagente de Transfecção |
| Coruja D2 Sistema de Eletroforese de Gel Largo | Coruja | D2-BP | Equipamento; Sistema de eletroforese em gel de ácido nucleico |
| PCR Primers, projetados (oligonucleotídeos de DNA de fita simples) | Tecnologia de DNA integrada | Reagente de | PCR NA, genotipagem |
| Phusion DNA polimerase de alta fidelidade (2 U/µ L) | Reagente de PCR Thermo Scientific | F530S | , genotipagem |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagente |
| Proteinase K Solução (20 mg / mL), grau de RNA | Invitrogen | 25530049 | reagente PCR, genotipagem |
| RNase A, DNase e livre de protease (10 mg / mL) | Thermo Scientific | EN0531 | , genotipagem |
| RPMI 1640 Medium | Reagente | de cultura Gibco MT10041CV | Tisuue; Mídia para células LNCaP |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; site: [snapgene.com] Uso: Programa de software de anotação de sequência de DNA para criar um arquivo de DNA para design de gRNA e que destaca o locus do cluster de miRNA (intergênico, intrônico), cada sequência individual de grampo de miRNA pertencente ao cluster de miRNA e outros genes codificantes e não codificantes próximos e/ou características regulatórias |
| Enzima TrypLE Select (1x), sem vermelho de fenol | Gibco | 12563029 | reagente de cultura Tisuue; Tripsina recombinante |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Reagente de eletroforese em gel de ácido nucleico |
| Veriti Termociclador rápido de 96 poços | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipamento |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | ; Sistema de eletroforese em gel de proteína |
Referências
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J.
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Reimpressões e permissões
