Ett nyutvecklat mikromönstrat chip med grafenoxidfönster tillverkas genom att tillämpa mikroelektromekaniska systemtekniker, vilket möjliggör effektiv och högkapacitet kryogen elektronmikroskopiavbildning av olika biomolekyler och nanomaterial.
En viktig begränsning för effektiv strukturanalys med hög genomströmning av biomolekyler med kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) är svårigheten att förbereda kryo-EM-prover med kontrollerad istjocklek på nanoskalan. Det kisel (Si)-baserade chipet, som har en vanlig uppsättning mikrohål med grafenoxidfönster (GO) mönstrat på en tjocklekskontrollerad kiselnitridfilm (SixNy), har utvecklats genom att tillämpa mikroelektromekaniska system (MEMS) tekniker. UV-fotolitografi, kemisk ångavsättning, våt och torr etsning av den tunna filmen och droppgjutning av 2D-nanoarkmaterial användes för massproduktion av de mikromönstrade chipsen med GO-fönster. Mikrohålens djup regleras för att kontrollera istjockleken på begäran, beroende på provets storlek för kryo-EM-analys. Den gynnsamma affiniteten hos GO mot biomolekyler koncentrerar biomolekylerna av intresse i mikrohålet under kryo-EM-provberedning. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster möjliggör kryo-EM-avbildning med hög genomströmning av olika biologiska molekyler, såväl som oorganiska nanomaterial.
Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) har utvecklats för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos proteiner i deras ursprungliga tillstånd 1,2,3,4. Tekniken innebär att proteiner fixeras i ett tunt skikt (10-100 nm) glasartad is och att man får projektionsbilder av slumpmässigt orienterade proteiner med hjälp av ett transmissionselektronmikroskop (TEM), med provet bibehållet vid flytande kvävetemperatur. Tusentals till miljoner projektionsbilder förvärvas och används för att rekonstruera en 3D-struktur av proteinet med hjälp av beräkningsalgoritmer 5,6. För framgångsrik analys med cryo-EM har kryoprovberedning automatiserats genom att doppa och frysa utrustningen som styr blottingförhållandena, fuktigheten och temperaturen. Provlösningen laddas på ett TEM-rutnät med ett håligt kolmembran, blottas successivt för att avlägsna överskottslösningen och störtfryses sedan med flytande etan för att producera tunn, glasaktig is 1,5,6. Med framstegen inom kryo-EM och automatiseringen av provberedning7 har kryo-EM alltmer använts för att lösa proteinernas struktur, inklusive kuvertproteiner för virus och jonkanalproteiner i cellmembranet 8,9,10. Strukturen hos kuvertproteiner av patogena viruspartiklar är viktig för att förstå virusinfektionspatologi, liksom för att utveckla diagnossystemet och vaccinerna, t.ex. SARS-CoV-211, som orsakade COVID-19-pandemin. Dessutom har kryo-EM-tekniker nyligen tillämpats på materialvetenskap, såsom för avbildning av strålkänsliga material som används i batteri 12,13,14 och katalytiska system 14,15 och analys av strukturen hos oorganiska material i lösningstillstånd16.
Trots märkbar utveckling inom kryo-EM och relevanta tekniker finns det begränsningar i kryoprovberedning, vilket hindrar 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Att förbereda en glasartad isfilm med optimal tjocklek är särskilt viktigt för att erhålla 3D-strukturen hos biologiska material med atomär upplösning. Isen måste vara tillräckligt tunn för att minimera bakgrundsbrus från elektroner som sprids av isen och för att förhindra överlappningar av biomolekyler längs elektronstrålens väg 1,17. Men om isen är för tunn kan det få proteinmolekyler att anpassa sig i föredragna riktningar eller denaturera 18,19,20. Därför bör tjockleken på glasis optimeras beroende på storleken på materialet av intresse. Dessutom krävs vanligtvis omfattande ansträngningar för provberedning och manuell screening av is- och proteinintegritet på de beredda TEM-gallren. Denna process är extremt tidskrävande, vilket hindrar dess effektivitet för 3D-strukturanalys med hög genomströmning. Därför skulle förbättringar av tillförlitligheten och reproducerbarheten av kryo-EM-provberedning förbättra användningen av kryo-EM i strukturbiologi och kommersiell läkemedelsupptäckt, liksom för materialvetenskap.
Här introducerar vi mikrofabrikationsprocesser för att göra ett mikromönstrat chip med grafenoxidfönster (GO) utformade för kryo-EM med hög genomströmning med kontrollerad istjocklek21. Det mikromönstrade chipet tillverkades med hjälp av mikroelektromekaniska systemtekniker (MEMS), som kan manipulera chipets struktur och dimensioner beroende på avbildningsändamålen. Det mikromönstrade chipet med GO-fönster har en mikrowellstruktur som kan fyllas med provlösningen, och mikrobrunnens djup kan regleras för att kontrollera tjockleken på glasisen. Gos starka affinitet för biomolekyler ökar koncentrationen av biomolekyler för visualisering, vilket förbättrar effektiviteten i strukturanalysen. Dessutom består det mikromönstrade chipet av en Si-ram, vilket ger hög mekanisk stabilitet för gallret19, vilket gör det idealiskt för hantering av chipet under provberedningsförfaranden och kryo-EM-avbildning. Därför ger ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkade av MEMS-tekniker tillförlitlighet och reproducerbarhet för kryo-EM-provberedning, vilket kan möjliggöra effektiv strukturanalys med hög genomströmning baserad på kryo-EM.
Mikrofabrikationsprocesserna för att producera mikromönstrade chips med GO-fönster introduceras här. Det tillverkade mikromönstrade chipet är utformat för att reglera tjockleken på glasartsskiktet genom att kontrollera mikrohålets djup med GO-fönster beroende på storleken på materialet som ska analyseras. Ett mikromönstrat chip med GO-fönster tillverkades med hjälp av en serie MEMS-tekniker och en 2D-nanoarköverföringsmetod (figur 1). Den största fördelen med att använda …
The authors have nothing to disclose.
M.-H.K., S.K., M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från Institute for Basic Science (Grant No. IBS-R006-D1). S.K., M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från Creative-Pioneering Researchers Program genom Seoul National University (2021) och NRF-bidraget finansierat av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1A2C2101871 och NRF-2021M3A9I4022936). M.L. och J.P. erkänner det ekonomiska stödet från POSCO Science Fellowship of POSCO TJ Park Foundation och NRF-bidraget som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2017R1A5A1015365). J.P. erkänner det ekonomiska stödet från det nrf-bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1A6C101A183) och de tvärvetenskapliga forskningsinitiativprogrammen från College of Engineering och College of Medicine, Seoul National University (2021). M.-H.K. erkänner det ekonomiska stödet från det nrf-bidrag som finansieras av den koreanska regeringen (MSIT; Bidrag nr. NRF-2020R1I1A1A0107416612). Författarna tackar personalen och besättningen på Seoul National University Center for Macromolecular and Cell Imaging (SNU CMCI) för deras outtröttliga ansträngningar och uthållighet med kryo-EM-experimenten. Författarna tackar SJ Kim från National Center for Inter-university Research Facilities för hjälp med FIB-SEM-experimenten.
1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
Acetone | |||
AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |