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Cancer Research

त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति का उपयोग करके मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेलुलर विविधता पूर्व विवो को बनाए रखना

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63745
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Neurological Surgery, Cleveland Clinic, 2Cardiovascular and Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Summary

यहां, हम प्राथमिक रोगी नमूनों या रोगी-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों से ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने और उन्हें परिपक्वता तक बनाए रखने की एक विधि का वर्णन करते हैं। इन जीबीएम ऑर्गेनोइड्स में फेनोटाइपिक रूप से विविध सेल आबादी होती है और ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट पूर्व विवो को फिर से बनाते हैं।

Abstract

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) एक बेहद खराब रोग का निदान के साथ सबसे अधिक होने वाला प्राथमिक घातक मस्तिष्क कैंसर है। इंट्रा-ट्यूमोरल सेलुलर और आणविक विविधता, साथ ही ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच जटिल बातचीत, प्रभावी उपचार खोजने को एक चुनौती बना सकती है। पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति विधियां ऐसी जटिलताओं को मुखौटा कर सकती हैं, जबकि त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति क्षेत्रीय माइक्रोएनवायरनमेंटल ग्रेडिएंट को पुन: प्राप्त कर सकती है। ऑर्गेनोइड्स त्रि-आयामी जीबीएम संस्कृति की एक विधि है जो रोगी ट्यूमर वास्तुकला की बेहतर नकल करती है, इसमें फेनोटाइपिक रूप से विविध सेल आबादी होती है, और इसका उपयोग मध्यम-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। यद्यपि त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति पारंपरिक संस्कृति की तुलना में अधिक श्रमसाध्य और समय लेने वाली है, यह अद्वितीय लाभ प्रदान करती है और वर्तमान इन विट्रो और विवो सिस्टम के बीच की खाई को पाटने का काम कर सकती है। ऑर्गेनोइड्स ने ट्यूमर व्यवहार और प्रतिरोध के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए कैंसर जीवविज्ञानियों के शस्त्रागार में खुद को अमूल्य उपकरण के रूप में स्थापित किया है, और उनके अनुप्रयोग केवल बढ़ते रहते हैं। यहां, जीबीएम ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने और बनाए रखने के तरीकों के बारे में विवरण प्रदान किया गया है। जमे हुए और पैराफिन-एम्बेडिंग तकनीकों दोनों का उपयोग करके ऑर्गेनोइड नमूना एम्बेडिंग और सेक्शनिंग करने के निर्देश, साथ ही ऑर्गेनोइड वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिशें, और कुल ऑर्गेनोइड सेल व्यवहार्यता का माप, सभी का भी वर्णन किया गया है।

Introduction

ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) निदान से लगभग 15 महीने के गंभीर पूर्वानुमान के साथ सबसे अधिक होने वाला प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमरहै। उपचार जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रभावी होते हैं, वे अक्सर रोगियों 2,3 में खराब प्रभावी हो सकते हैं। खराब नैदानिक प्रतिक्रिया को कई कारकों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जिसमें जीबीएम की सूक्ष्म पर्यावरणीय विषमता और जटिल इंट्रा-ट्यूमरल इंटरैक्शन शामिल हैं। पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति विधियों के साथ प्रयोगशाला सेटिंग में इन्हें फिर से बनाना मुश्किल हो सकताहै 4. जीबीएम के भीतर स्व-नवीनीकरण कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) के सबसेट की उपस्थिति भी इस जटिलता 5,6 में योगदान दे सकती है। सीएससी ट्यूमर प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैं और सक्रिय एंजियोजेनेसिस, कैंसर आक्रमण और विकिरण 7,8,9 सहितउपचारों के प्रतिरोध को बढ़ावा देकर ट्यूमर के विकास को बनाए रखते हैं। सीएससी ट्यूमर में समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, बल्कि विशिष्ट सूक्ष्म वातावरण के भीतर समृद्ध होते हैं, जिसमें पेरिवास्कुलर आला और पेरिनेक्रोटिक क्षेत्र शामिल हैं, जो प्रत्येक अपने सेलुलर राज्यों 10,11,12,13,14 के अलग-अलग आणविक विनियमन प्रदान करते हैं। सीएससी माइक्रोएनवायरनमेंटल संकेतों के निष्क्रिय प्राप्तकर्ता नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय अपने स्वयं के माइक्रोएन्वायरमेंट 7,15,16 को फिर से तैयार करने की क्षमता रखते हैं। सीएससी का सूक्ष्म वातावरण पोषक तत्वों की कमी, पीएच और हाइपोक्सिया17,18,19,20 जैसे दबावों के जवाब में स्टेम सेल राज्य के रखरखाव को बढ़ावा दे सकता है, जो एक मॉडल प्रणाली में इन स्थितियों के महत्व का सुझाव देता है। ट्यूमर के भीतर विविध सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट का पुनरावृत्ति इसलिए चिकित्सीय प्रतिरोध को समझने और उपन्यास उपचारों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है।

त्रि-आयामी संस्कृति हाल के वर्षों में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है21,22. ऑर्गेनोइड का उपयोग अन्य प्रकार के कैंसर में किया गया है, और ऑर्गेनोइड के रूप में कोशिकाओं को बनाए रखने का प्राथमिक लक्ष्य विषम कोशिका आबादी (जिनमें से कई सामान्य रूप से अधिक सजातीय क्षेत्र संस्कृति में आगे निकल सकते हैं) और स्थानिक विविधता के विकास की अनुमति देना है, जिसे आनुवंशिक विशिष्टता 4,23,24,25,26 के साथ क्षेत्रीय ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के रूप में देखा जाता है . कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी संस्कृति के लिए कई तरीके हैं, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और नुकसान 27,28,29 हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति के प्रतिस्थापन का इरादा नहीं है। यह दो आयामी तरीकों के पूरक तकनीक के रूप में सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है जब विशिष्ट प्रश्न होते हैं जहां सेल माइक्रोएन्वायरमेंट और ट्यूमर सेल प्रतिक्रियाओं के बीच बातचीत महत्वपूर्ण होती है।

यह आलेख प्राथमिक रोगी नमूनों या रोगी-व्युत्पन्न संस्कृतियों से जीबीएम ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए विश्वसनीय और दोहराने योग्य तरीकों का वर्णन करता है। हम त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए दो अलग-अलग उद्देश्यों को संबोधित करते हैं: (1) प्राथमिक रोगी ऊतक से ऑर्गेनोइड की स्थापना, एकरूपता की परवाह किए बिना अधिकतम एनग्राफ्टमेंट क्षमता के साथ, या (2) अधिक मात्रात्मक प्रयोगात्मक उपयोग के लिए समान ऑर्गेनोइड बढ़ रहा है। ऑर्गेनोइड के रूप में एक प्राथमिक नमूने की स्थापना करते समय, एकल कोशिकाओं या गिनती कोशिकाओं के लिए फ़िल्टर करना आवश्यक नहीं है, क्योंकि प्रारंभिक संस्कृति स्थापित करने के लिए अधिकतम सेल नंबर और प्रकार रखना प्राथमिकता है। तुलनात्मक प्रयोगों के लिए ऑर्गेनोइड बढ़ते समय, हालांकि, एकल-कोशिका निस्पंदन और सेल गिनती की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रतिकृति ऑर्गेनोइड प्रयोगात्मक स्थिरता के लिए तुलनीय हैं। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने और समान ऑर्गेनोइड बनाने के साथ-साथ ऑर्गेनोइड और मानक सेल संस्कृति प्रयोगों को एम्बेड करने और संरक्षित करने के लिए परिष्कृत तरीकों का विवरण देता है, जिसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और जीबीएम ऑर्गेनोइड में कुल सेल व्यवहार्यता का आकलन शामिल है।

Protocol

नीचे विस्तृत प्रोटोकॉल (ओं) के सभी चरणों को क्लीवलैंड क्लिनिक इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी) प्रोटोकॉल # 2559 और संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) अनुमोदन # 1711 के अनुसार विकसित और संचालित किया गया था। गोले और ऑर्गेनोइड "न्यूरोबेसल मीडिया कम्प्लीट" (एनबीएमसी) में सुसंस्कृत हैं। निर्देशों के लिए तालिका 1 देखें।

1. ऑर्गेनोइड मोल्ड बनाना

  1. पैराफिल्म शीट (आकार में लगभग 4 सेमी x 4 सेमी) से मोम पेपर लें और इसे दो बाँझ 96-अच्छी तरह से पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) प्लेटों के बीच रखें।
    1. संस्कृति हुड में इन चरणों को करें और पैराफिल्म के "अंदर" (कागज द्वारा कवर किया गया पक्ष) को साफ रखने के लिए विशेष ध्यान रखें। इस साफ पक्ष को इंडेंटेशन की उत्तलता बनानी चाहिए।
  2. पैराफिल्म में छोटे डिंपल बनाने के लिए शीर्ष 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट पर भी दबाव लागू करें। लक्ष्य पैराफिल्म में छेद किए बिना डिंपल को गहराई में लगभग 2 मिमी होना है।
  3. दो 96-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेटों को धीरे से अलग करें। डिंपल पैराफिल्म शीर्ष प्लेट से चिपक जाएगी। इसे सूखी बर्फ पर लगभग 30 सेकंड के लिए रखें।
  4. पैराफिल्म 30 एस के लिए सूखी बर्फ पर किया गया है के बाद, शीर्ष 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट से पैराफिल्म खींचने के लिए बाँझ संदंश का उपयोग करें।
    1. पैराफिल्म को हटाते समय, बहुत "सावधान" होने के बजाय त्वरित गति का उपयोग करें। जमे हुए पैराफिल्म को गर्म पैराफिल्म की तुलना में हटाना आसान है, जिससे डिंपल पलट सकते हैं।
  5. एक कवर, बाँझ 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में पूरा पैराफिल्म मोल्ड रखें। बाँझपन बनाए रखने पर मोल्ड्स को पहले से बनाया जा सकता है और संग्रहीत किया जा सकता है।

2. रोगी ऊतक नमूने के मैक्रोडिसेक्शन

  1. एक बाँझ संस्कृति पकवान (10 सेमी सेल संस्कृति प्लेटों) में, दो बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करें ताकि यहां तक कि दबाव लागू करते समय रोगी के नमूने को बारीक कीमा बनाया जा सके।
    नोट: संस्कृति पकवान पर एनबीएसी के लगभग 500 μL के साथ नमूना कीमा बनाना सबसे आसान है। रेजर ब्लेड के साथ जितना संभव हो उतना बारीक टुकड़ों को कीमा बनाने का प्रयास करें; आदर्श रूप से, व्यक्तिगत टुकड़े 1 मिमी3 या उससे छोटे होते हैं।
  2. एक कट पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग कर एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए बारीक कीमा बनाया हुआ ट्यूमर टुकड़े स्थानांतरण।
    नोट: जब भी ऑर्गेनोइड को संभालते हैं, तो केवल कट पी 1000 पिपेट युक्तियों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इन्हें वांछित उद्घाटन आकार (मोटे तौर पर 5 और 8 मिमी के बीच) और आटोक्लेव करने के लिए एक तेज रेजर का उपयोग करके काटा जा सकता है।
  3. कमरे के तापमान (आरटी) सेल टुकड़ी समाधान (सामग्री की तालिका) के 2 एमएल जोड़ें और इसे लगभग 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: निरीक्षण करें और हर कुछ मिनट मिश्रण। कुछ सेल टुकड़ी समाधान या नमूनों को इनक्यूबेशन समय अलग-अलग की आवश्यकता हो सकती है। यदि क्लंपिंग दिखाई देती है, जो सेल लिसिस के कारण डीएनए रिलीज का संकेत दे सकती है, तो तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  4. सेल टुकड़ी समाधान को बेअसर करने के लिए एनबीएमसी मीडिया के 8 एमएल जोड़ें, और 65 एक्स जी पर 3 मिनट के लिए स्पिन करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला की आकांक्षा करें और एनबीएमसी के 1-2 एमएल में ऊतक को फिर से निलंबित करें।

3. प्राथमिक रोगी ऊतक से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करना

नोट: प्राथमिक रोगी ऊतक से ऑर्गेनोइड बनाते समय लक्ष्य तीन आयामी संस्कृति स्थापित करना है। एकल कोशिकाओं या गिनती कोशिकाओं के लिए फ़िल्टर न करें, लेकिन दृश्य निरीक्षण का उपयोग करके प्रारंभिक सेल लोड को यथासंभव समान रखें। प्रारंभिक ऑर्गेनोइड के विकास और स्थापना में विषमता होना सामान्य है। प्रत्येक ऑर्गेनोइड मात्रा में 20 μL होगा (लैमिनिन समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (एलआरईसीएम) के 16 μL और चरण 2.5 से एनबीएमसी में निलंबित ऊतक के 4 μL)। निर्देशों को ऑर्गेनोइड की संख्या के लिए समायोजित किया जा सकता है; लक्ष्य आमतौर पर प्राथमिक रोगी नमूनों से लगभग 20-30 ऑर्गेनोइड बनाना है।

  1. एक बर्फ की बाल्टी या ठंडे ब्लॉक में, एलआरईसीएम और एक छोटी अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें। छोटे अपकेंद्रित्र ट्यूब में एलआरईसीएम (16 μL x इच्छित ऑर्गेनोइड की एक्स संख्या) की उचित मात्रा रखें।
  2. बर्फ पर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए चरण 2.5 (इच्छित ऑर्गेनोइड की 4 μL x संख्या) से ऊतक निलंबन की उचित मात्रा जोड़ें।
  3. ध्यान से पिपेट पैराफिल्म मोल्ड्स पर एलआरईसीएम/सेल निलंबन मिश्रण के 20 μL; यह मोती जैसी बूंद बनाएगा।
    1. सेल निलंबन मिश्रण को अच्छी तरह से मिश्रण करना सुनिश्चित करें; कोशिकाएं एलआरईसीएम के भीतर आसानी से बस जाती हैं, जिसके परिणामस्वरूप विषम ऑर्गेनोइड होते हैं।
    2. बर्फ पर एलआरईसीएम /सेल निलंबन मिश्रण रखें। यदि एलआरईसीएम गर्म हो जाता है, तो यह ऑर्गेनोइड गठन को बहुलक और समझौता कर सकता है। एलआरईसीएम पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए हर दो से तीन ऑर्गेनोइड में पिपेट टिप को ठंडा करना सुनिश्चित करें। ऑर्गेनोइड में हवा के बुलबुले पेश न करें (पिपेट को "डबल धक्का" से बचें)।
  4. एक बार ऑर्गेनोइड की वांछित संख्या 10 सेमी सेल संस्कृति प्लेट में पैराफिल्म मोल्ड पर पाइप की जाती है, प्लेट ढक्कन के साथ कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में सेते हैं,1-2 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
  5. ऑर्गेनोइड जमने के बाद, एनबीएमसी मीडिया का उपयोग उन्हें पैराफिल्म मोल्ड से धीरे-धीरे फ्लश करने के लिए करें और एनबीएमसी कुल 20 एमएल के साथ एक नई, बाँझ 10 सेमी संस्कृति प्लेट में। पी 1000 टिप का उपयोग मोल्ड से ऑर्गेनोइड को फ्लश करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है; वे धीरे-धीरे स्लाइड करेंगे।
    नोट: जब ऑर्गेनोइड को मोल्ड्स से सेल कल्चर प्लेटों में फ्लश किया जाता है, तो उन्हें मीडिया में छोटे गुलाबी गोले के रूप में दिखाई देना चाहिए। यदि ऑर्गेनोइड मीडिया में अलग हो गए हैं या बिखर गए हैं, तो यह एलआरईसीएम के साथ पहले के मुद्दे को इंगित करता है, और ऑर्गेनोइड अभी भी बढ़ सकते हैं लेकिन आकार में समान होने की संभावना नहीं होगी।
  6. 4 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 (मिलाते हुए बिना) पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 10 सेमी संस्कृति पकवान रखें।
    नोट: शुरुआती दिनों में एक कक्षीय शेकर पर ऑर्गेनोइड रखने से वे अलग हो सकते हैं। सुनिश्चित करें कि वे 4 दिन तक हिल नहीं रहे हैं।
  7. 4 दिनों के बाद, मीडिया का आदान-प्रदान करें और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 80 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर रखें।
    1. अपरिपक्व ऑर्गेनोइड के साथ मीडिया का आदान-प्रदान करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि उन्हें कल्पना करना मुश्किल है। सेल संस्कृति पकवान झुकाव और कम से कम 20 एस के लिए प्रतीक्षा करें; ऑर्गेनोइड नीचे बस जाएंगे और ऊपर से मीडिया को धीरे-धीरे ग्लास या प्लास्टिक 10-20 एमएल पिपेट के साथ हटाने की अनुमति देंगे।
    2. तल पर ऑर्गेनोइड के संग्रह पर सावधानीपूर्वक ध्यान दें; यदि वे मीडिया हटाने के बल के साथ उत्तेजित दिखाई देते हैं, तो उन्हें रोकना और उन्हें फिर से बसाने की अनुमति देना सबसे अच्छा है। जैसे-जैसे ऑर्गेनोइड परिपक्व होते हैं और कल्पना करना आसान होता है, यह प्रक्रिया कम सूक्ष्म हो जाती है।
      नोट: कभी-कभी, सेल संस्कृति प्लेट के नीचे अंधेरे कागज का एक टुकड़ा रखने से अपरिपक्व ऑर्गेनोइड की कल्पना करने में मदद मिल सकती है। मीडिया को हटाने के लिए वैक्यूम चूषण के साथ पाश्चर पिपेट का उपयोग न करने की सलाह दी जाती है क्योंकि ऑर्गेनोइड को चूसा जाना और इस तरह से खोजना बहुत आसान है।
    3. जब ऑर्गेनोइड पहली बार स्थापित होते हैं, तो वे परिपक्व ऑर्गेनोइड के रूप में तेजी से मीडिया का उपभोग नहीं करते हैं। 50% मीडिया एक्सचेंजों के साथ शुरुआत अनावश्यक मीडिया उपयोग को कम करती है और मीडिया विनिमय प्रक्रिया के दौरान गलती से नए ऑर्गेनोइड को नुकसान पहुंचाने या आकांक्षा करने की संभावना को कम करती है।

4. स्थापित जीबीएम क्षेत्र, अनुयायी, या ऑर्गेनोइड संस्कृति से ऑर्गेनोइड उत्पन्न करना

नोट: यहां लक्ष्य ऑर्गेनोइड बनाना है जो तुलनात्मक प्रयोगों में उपयोग के लिए आकार और सेल मात्रा में समान हैं, इसलिए इसे सुनिश्चित करने के लिए एकल-सेल फ़िल्टर और गिनती कोशिकाओं का उपयोग करें।

  1. जीबीएम क्षेत्र संस्कृति से एकल-सेल निलंबन तैयार करना।
    नोट: जीबीएम कोशिकाओं के क्षेत्र संस्कृतियों को एनबीएमसी मीडिया में बनाए रखा जाता है।
    1. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में गोले रखें और 5 मिनट के लिए 120 एक्स जी पर स्पिन करें।
    2. सतह पर तैरनेवाला निकालें और आरटी सेल टुकड़ी समाधान के 2 एमएल जोड़ें। 3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें।
    3. सेल टुकड़ी समाधान को बेअसर करने के लिए एनबीएमसी मीडिया के 8 एमएल जोड़ें। एक एकल सेल छलनी (70 μm) के माध्यम से तनाव और 120 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन।
    4. ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें और एनबीएसी के ~ 1 एमएल में शेष कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें कोशिकाओं की गणना करें (सेल अभेद्य दाग का उपयोग करके) और चरण 4.4 पर जाएं।
  2. जीबीएम अनुयायी संस्कृति से एकल-सेल निलंबन तैयार करना।
    1. प्लेट से इस्तेमाल किया मीडिया निकालें, प्लेट के लिए आरटी सेल टुकड़ी समाधान के 2 एमएल जोड़ें, और 3 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जगह है।
    2. माइक्रोस्कोप के तहत पुष्टि करें कि कोशिकाओं को प्लेट से अलग किया जाता है।
    3. सेल टुकड़ी समाधान को बेअसर करने के लिए एनबीएमसी मीडिया के 8 एमएल जोड़ें। एक एकल-कोशिका छलनी (70 μm) के माध्यम से तनाव।
      नोट: अनुयायी संस्कृति के साथ काम करते समय एकल सेल तनाव वैकल्पिक है।
    4. 120 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन। ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें और एनबीएसी के ~ 1 एमएल में शेष कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें कोशिकाओं की गणना करें (सेल अभेद्य दाग का उपयोग करके) और चरण 4.4 पर जाएं।
  3. जीबीएम ऑर्गेनोइड संस्कृति से एकल-कोशिका निलंबन तैयार करना।
    1. एक 10 सेमी संस्कृति प्लेट के लिए एक कटौती p1000 विंदुक टिप का उपयोग कर ऑर्गेनोइड स्थानांतरण और ध्यान से संभव के रूप में ज्यादा अवशिष्ट मीडिया को हटाने।
    2. दो बाँझ रेजर का उपयोग करके, सावधानीपूर्वक ऑर्गेनोइड को बारीक कीमा बनाएं। कट पी 1000 टिप के साथ, कीमा बनाया हुआ ऑर्गेनोइड को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ले जाएं और एनबीएमसी मीडिया के ~ 2-3 एमएल जोड़ें।
    3. 3 मिनट के लिए 120 एक्स जी पर स्पिन और सतह पर तैरनेवाला को हटाने (इस भाग के लिए वैक्यूम चूषण के बजाय एक विंदुक टिप का उपयोग करने की सलाह देते हैं)।
    4. 10 मिनट के लिए ठंड सेल टुकड़ी समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: सेल टुकड़ी समाधान सीधे 4 डिग्री सेल्सियस से इस्तेमाल किया जाना चाहिए, पहले गर्म नहीं। यह किसी भी शेष मैट्रिगेल को नरम करने और सेल रिकवरी में सहायता करने के लिए प्रतीत होता है।
    5. फिर 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर पर जाएं, हर कुछ मिनटों में अवलोकन और मिश्रण करें। यदि क्लंपिंग दिखाई देती है, जो सेल लिसिस को इंगित कर सकती है, तो तुरंत अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    6. सेल टुकड़ी समाधान को पतला करने के लिए एनबीएमसी मीडिया के 8 एमएल जोड़ें। एक एकल कोशिका छलनी (70 μm) के माध्यम से तनाव और 120 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन।
    7. ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला निकालें और एनबीएसी के ~ 1 एमएल में शेष कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें कोशिकाओं की गणना करें (सेल अभेद्य दाग का उपयोग करके) और चरण 4.4 पर आगे बढ़ें।
  4. एकल-कोशिका निलंबन से ऑर्गेनोइड बनाना
    1. एक बर्फ की बाल्टी या ठंडे ब्लॉक में, एलआरईसीएम और एक छोटी अपकेंद्रित्र ट्यूब रखें। छोटे अपकेंद्रित्र ट्यूब में एलआरईसीएम (16 μL x इच्छित ऑर्गेनोइड की एक्स संख्या) की उचित मात्रा रखें।
    2. कुल मात्रा (इच्छित ऑर्गेनोइड की 4 μL x X संख्या) में कोशिकाओं का मिश्रण बनाएं जिसमें 20,000 कोशिकाएं / ऑर्गेनोइड होंगी और इसे बर्फ पर एलआरईसीएम के साथ छोटे अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें।
    3. ध्यान से पिपेट पैराफिल्म मोल्ड्स पर एलआरईसीएम/सेल निलंबन मिश्रण के 20 μL; यह मोती जैसी बूंद बनाएगा।
      1. सेल निलंबन मिश्रण को अच्छी तरह से मिश्रण करना सुनिश्चित करें, क्योंकि कोशिकाएं एलआरईसीएम के भीतर आसानी से व्यवस्थित हो जाती हैं, और इसके परिणामस्वरूप विषम ऑर्गेनोइड होंगे।
      2. बर्फ पर एलआरईसीएम /सेल निलंबन मिश्रण रखें। यदि एलआरईसीएम गर्म हो जाता है, तो यह ऑर्गेनोइड गठन को बहुलक और समझौता कर सकता है।
      3. एलआरईसीएम पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए हर दो से तीन ऑर्गेनोइड में पिपेट टिप को ठंडा करना सुनिश्चित करें। ऑर्गेनोइड में हवा के बुलबुले पेश न करें (पिपेट टिप को "डबल धक्का" से बचें)।
    4. एक बार ऑर्गेनोइड की वांछित संख्या 10 सेमी संस्कृति प्लेट में पैराफिल्म मोल्ड पर पाइप की जाती है, तो सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. ऑर्गेनोइड जमने के बाद, एनबीएमसी मीडिया का उपयोग उन्हें पैराफिल्म मोल्ड से धीरे-धीरे फ्लश करने के लिए करें और एनबीएमसी कुल 20 एमएल के साथ एक नई, बाँझ 10 सेमी संस्कृति प्लेट में। पी 1000 टिप का उपयोग मोल्ड से ऑर्गेनोइड को फ्लश करने के लिए सबसे अच्छा काम करता है; वे धीरे-धीरे स्लाइड करेंगे।
      नोट: प्रति 10 सेमी संस्कृति पकवान के बारे में 15-20 ऑर्गेनोइड की सिफारिश की जाती है।
    6. 4 दिनों के लिए एक इनक्यूबेटर (मिलाते बिना) में 10 सेमी संस्कृति पकवान रखें।
    7. 4 दिनों के बाद, मीडिया का आदान-प्रदान करें और सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 80 आरपीएम पर एक कक्षीय शेकर पर रखें। इसके बाद हर 2-3 दिनों में मीडिया का आदान-प्रदान करें।
      1. अपरिपक्व ऑर्गेनोइड के साथ मीडिया का आदान-प्रदान करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि उन्हें कल्पना करना मुश्किल है। सेल संस्कृति पकवान झुकाव और कम से कम 20 एस के लिए प्रतीक्षा करें; ऑर्गेनोइड नीचे बस जाएंगे और ऊपर से मीडिया को धीरे-धीरे एक बड़े उद्घाटन ग्लास पिपेट के साथ हटाने की अनुमति देंगे।
      2. तल पर ऑर्गेनोइड के संग्रह पर सावधानीपूर्वक ध्यान दें; यदि वे मीडिया हटाने के बल के साथ उत्तेजित दिखाई देते हैं, तो रोकें और उन्हें फिर से बसने की अनुमति दें। जैसे-जैसे ऑर्गेनोइड परिपक्व होते हैं और कल्पना करना आसान होता है, यह प्रक्रिया कम सूक्ष्म हो जाती है।
        नोट: कभी-कभी, सेल संस्कृति प्लेट के नीचे अंधेरे कागज का एक टुकड़ा रखने से अपरिपक्व ऑर्गेनोइड की कल्पना करने में मदद मिल सकती है। मीडिया को हटाने के लिए वैक्यूम चूषण के साथ पाश्चर पिपेट का उपयोग न करें क्योंकि ऑर्गेनोइड को चूसा जाना और इस तरह से खोजना बहुत आसान है।
      3. जब ऑर्गेनोइड पहली बार स्थापित होते हैं, तो वे परिपक्व ऑर्गेनोइड के रूप में तेजी से मीडिया का उपभोग नहीं करते हैं। अनावश्यक मीडिया उपयोग को कम करने और मीडिया विनिमय प्रक्रिया के दौरान गलती से नए ऑर्गेनोइड को नुकसान पहुंचाने या आकांक्षा करने की संभावना को कम करने के लिए 50% मीडिया एक्सचेंजों से शुरू करें।

5. क्रायोएम्बेडिंग

  1. प्रत्येक ऑर्गेनोइड को एक व्यक्तिगत 1.5 एमएल ट्यूब (कट पी 1000 टिप का उपयोग करके) में रखें जिसमें 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का 1 एमएल हो। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ऑर्गेनोइड स्टोर करें। यदि पैराफिन में ऑर्गेनोइड एम्बेड करते हैं, तो धारा 6 पर आगे बढ़ें।
  2. 4% पीएफए में रातोंरात निर्धारण के बाद, ऑर्गेनोइड को 1 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में तीन बार धो लें।
  3. पानी में 30% सुक्रोज के 1 एमएल युक्त एक नए 1.5 एमएल ट्यूब (कट पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके) में ऑर्गेनोइड को स्थानांतरित करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. क्रायोमोल्ड में इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) की एक छोटी मात्रा (आमतौर पर 1-2 एमएल) जोड़ें, नीचे को कवर करें और मोल्ड की गहराई का लगभग 1/3 से 1/2 भरें।
  5. कट पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके क्रायोमोल्ड में एक एकल ऑर्गेनोइड स्थानांतरित करें। इसके परिणामस्वरूप कुछ मीडिया ऑर्गेनोइड के साथ स्थानांतरित हो जाएंगे, जो अपरिहार्य है। ऑर्गेनोइड को परेशान किए बिना आसपास के मीडिया को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए एक छोटे पिपेट टिप का उपयोग करें।
    नोट: यह कल्पना करना मुश्किल हो सकता है, लेकिन धीमी गति से पाइपिंग मीडिया और ओसीटी के बीच घनत्व में स्पष्ट अंतर प्रदर्शित करेगी, इसलिए यह कुछ हद तक "महसूस करके" किया जाता है)।
  6. क्रायोमोल्ड को सूखी बर्फ की ट्रे पर रखें। ओसीटी ठंड लगना शुरू कर देगा, प्रक्रिया में अपारदर्शी हो जाएगा।
  7. ऑर्गेनोइड को पूरी तरह से कवर करने के लिए अतिरिक्त ओसीटी जोड़ें, क्रायोमोल्ड की बाकी मात्रा को भरें। ब्लॉक को कई दिनों के लिए अल्पकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर या अनिश्चित काल तक दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. पैराफिन एम्बेडिंग

  1. ऑर्गेनोइड को आकार के अनुसार सॉर्ट करें (छोटे ऑर्गेनोइड 3 मिमी से नीचे हैं, बड़े ऑर्गेनोइड 3 मिमी से अधिक हैं)। एक कट पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करके प्रत्येक ऑर्गेनोइड को हिस्टोलॉजी कैसेट में स्थानांतरित करें और तालिका 2 या तालिका 3 के अनुसार पैराफिन मोम में प्रक्रिया करें।
    नोट: ऊतक विज्ञान कैसेट का आकार/कॉन्फ़िगरेशन उपयोगकर्ता पर निर्भर है।
  2. पिघले हुए पैराफिन मोम के 1-2 मिलीलीटर के साथ एम्बेडिंग मोल्ड्स के लिए कैसेट से ऑर्गेनोइड स्थानांतरित करें और इसे तब तक ठंडा करें जब तक कि मोम अर्धठोस न हो जाए।
  3. एक बार मोम आंशिक रूप से जम जाने के बाद, मोल्ड के शीर्ष पर अधिक मोम जोड़ें। मोल्ड के ऊपर लेबल वाले कैसेट टॉप रखें और इसे कोल्ड प्लेट में ट्रांसफर करें। जब तक मोम पूरी तरह से ठोस न हो जाए तब तक ठंडा करते रहें।
  4. जब मोम जम जाता है, तो माइक्रोटोम का उपयोग करके ब्लॉक को अनुभाग करें। वैकल्पिक रूप से, बाद में सेक्शनिंग के लिए आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ)

  1. निम्नलिखित चरणों के अनुसार, स्लाइड धुंधला पकवान का उपयोग करके 5-12 μm पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों को डी-पैराफिनाइज और पुनर्जलीकरण करें।
    नोट: यदि ओसीटी-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड से अनुभागों का उपयोग कर रहे हैं, तो हम 12 μm अनुभागों का उपयोग करने की सलाह देते हैं। 30 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड मिलाते हुए ओसीटी निकालें। चरण 7.2 पर जाएं।
    1. जाइलीन में 5 मिनट के लिए सेते हैं। इसे दो बार दोहराएं। फिर 100% इथेनॉल में 10 मिनट के लिए सेते हैं। इसे एक बार फिर दोहराएं।
    2. 95% इथेनॉल में 10 मिनट के लिए सेते हैं। इसे एक बार फिर दोहराएं। 5 मिनट के लिए आसुत जल में वर्गों को धो लें, दो बार।
  2. एंटीजन अनमास्किंग के लिए, 1एक्स साइट्रेट अनमास्किंग समाधान (सामग्री की तालिका) में स्लाइड को डुबोएं और 10 मिनट के लिए उप-उबलते तापमान पर माइक्रोवेव करें। सुनिश्चित करें कि समाधान को उबलने न दें।
    नोट: यह सबसे अच्छा हासिल किया जाता है यदि उबलते समय तक ~ 2 मिनट के लिए शुरू में माइक्रोवेव किया जाता है, तो बिजली को कम करना और यह सुनिश्चित करने के लिए देखना कि समाधान उबलता नहीं है। पसंदीदा अनमास्किंग तापमान 100 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, आदर्श रूप से 98 डिग्री सेल्सियस।
  3. स्लाइड को 1 एक्स साइट्रेट अनमास्किंग समाधान में आरटी पर 30 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
    नोट: यह एक ही 1x साइट्रेट समाधान है; समाधान को इस चरण में प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता नहीं है।
  4. 5 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड धो लें, दो बार।
  5. 5 मिनट के लिए 1x टीबीएसटी (0.1% ट्वीन 20 के साथ ट्रिस-बफर खारा) बफर में स्लाइड धो लें।
  6. टीबीएसटी से स्लाइड निकालें और ऊतक अनुभाग को सूखने न देने के लिए सावधान रहते हुए प्रयोगशाला सफाई पोंछे का उपयोग करके ऊतक वर्गों के चारों ओर सावधानीपूर्वक उन्हें सुखाएं। एक बार स्लाइड पर्याप्त रूप से सूखने के बाद, हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन के साथ ऊतक वर्गों को सर्कल करें।
  7. आरटी पर 1 घंटे के लिए 10% सीरम अवरुद्ध समाधान के 100-400 μL के साथ प्रत्येक अनुभाग को अवरुद्ध करें माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर सीरम अवरुद्ध समाधान चुनें। उदाहरण के लिए, यदि गधे में बने माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो 1x टीबीएसटी में 10% सामान्य गधे सीरम का उपयोग करें।
  8. अवरुद्ध समाधान निकालें और फिर अवरुद्ध समाधान में वांछित एकाग्रता के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100-400 μL जोड़ें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर, रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ वर्गों सेते हैं।
  10. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 1x टीबीएसटी में स्लाइड धो लें, तीन बार।
  11. प्रत्येक अनुभाग में माध्यमिक एंटीबॉडी के 100-400 μL (अवरुद्ध समाधान में 1: 1000 कमजोर पड़ने, या निर्माता के निर्देशों के अनुसार) जोड़ें और आरटी पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं।
  12. 5 मिनट के लिए 1x TBST में स्लाइड धो लें, दो बार. फिर 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस में स्लाइड धो लें।
  13. पीबीएस से स्लाइड निकालें और एक प्रयोगशाला सफाई पोंछ का उपयोग कर ऊतक वर्गों के आसपास उन्हें सूखी। तरल इलाज माउंटेंट की कुछ बूंदें जोड़ें और एक ग्लास कवरस्लिप को ध्यान से माउंट करें। एक बार स्लाइड सूखने के बाद, इमेजिंग के लिए तैयार होने तक प्रकाश से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

8. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. निम्नलिखित चरणों के अनुसार, स्लाइड धुंधला पकवान का उपयोग करके पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों को डी-पैराफिनाइज और पुनर्जलीकरण करें।
    नोट: यदि ओसीटी-एम्बेडेड ऑर्गेनोइड से वर्गों का उपयोग कर रहे हैं, तो 30 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड को हिलाकर ओसीटी को हटा दें। चरण 8.2 पर जाएं।
    1. जाइलीन में 5 मिनट के लिए सेते हैं। इसे दो बार दोहराएं।
    2. 100% इथेनॉल में 10 मिनट के लिए सेते हैं। इसे एक बार फिर दोहराएं।
    3. 95% इथेनॉल में 10 मिनट के लिए सेते हैं। इसे एक बार फिर दोहराएं।
    4. 5 मिनट के लिए आसुत जल में वर्गों धो लें, दो बार।
  2. एंटीजन अनमास्किंग के लिए, 1एक्स साइट्रेट अनमास्किंग समाधान में स्लाइड डुबोएं और 10 मिनट के लिए उप-उबलते तापमान पर माइक्रोवेव करें। सुनिश्चित करें कि समाधान को उबलने न दें।
  3. स्लाइड को 1एक्स साइट्रेट अनमास्किंग समाधान में आरटी पर 30 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
  4. आसुत जल में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें, तीन बार।
  5. 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड में 10 मिनट के लिए स्लाइड सेते हैं।
  6. आसुत जल में 5 मिनट के लिए स्लाइड को दो बार धो लें।
  7. 1x टीबीएसटी में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें।
  8. 1x TBST से स्लाइड निकालें और फिर ऊतक वर्गों के आसपास ध्यान से सूखने के लिए एक प्रयोगशाला सफाई पोंछे के कोने का उपयोग करें।
  9. स्लाइड सूखने के बाद हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन के साथ ऊतक वर्गों को सर्कल करें।
  10. 1 घंटे के लिए आरटी पर हाइड्रोफोबिक बाधा पेन सर्कल के भीतर प्रत्येक अनुभाग पर अवरुद्ध समाधान के 100-400 μL रखें। 1x टीबीएसटी में पतला 10% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) या 0.75% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) का उपयोग करें।
  11. अगला, अवरुद्ध समाधान को हटा दें और प्रत्येक अनुभाग में प्राथमिक एंटीबॉडी के 100-400 μL जोड़ें। उपयुक्त निर्माता के पतला का उपयोग करके वांछित एकाग्रता के लिए इस प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
  12. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर वर्गों सेते हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और 5 मिनट के लिए 1x टीबीएसटी में स्लाइड धो लें, तीन बार।
  13. प्रत्येक अनुभाग में आईएचसी डिटेक्शन अभिकर्मक के 100-400 μL जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं प्राथमिक एंटीबॉडी के अनुसार आईएचसी डिटेक्शन अभिकर्मक चुनें।
  14. 5 मिनट के लिए 1x TBST के साथ प्रत्येक अनुभाग धो, दो बार, एक बार 5 मिनट के लिए 1x पीबीएस द्वारा पीछा किया।
  15. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 3,3-डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) समाधान तैयार करें। प्रत्येक ऊतक अनुभाग के लिए डीएबी समाधान के 100-400 μL जोड़ें और एक माइक्रोस्कोप के तहत बारीकी से निगरानी। 1-10 मिनट के बीच स्वीकार्य धुंधला तीव्रता प्रदान करेगा; इस समय को नोट करना सुनिश्चित करें और सभी ऊतक वर्गों के लिए सुसंगत रहें।
  16. वांछित धुंधला तीव्रता तक पहुंचने के बाद, आसुत जल में स्लाइड विसर्जित करें।
  17. तालिका 4 में दिए गए निर्देशों के अनुसार बढ़ते के लिए हेमटॉक्सिलिन काउंटरस्टेन और स्लाइड निर्जलीकरण करें।
  18. जाइलीन विकल्प (सामग्री की तालिका) से स्लाइड निकालें और एक प्रयोगशाला सफाई पोंछ का उपयोग करके ऊतक अनुभाग के चारों ओर अतिरिक्त तरल मिटा दें। ऊतक अनुभाग पर कवरस्लिप माउंट करने के लिए स्थायी बढ़ते माध्यम की एक छोटी मात्रा का उपयोग करें और सूखने की अनुमति दें।

9. कुल सेल व्यवहार्यता का मापन

  1. एक 2 एमएल ट्यूब के लिए प्रत्येक ऑर्गेनोइड स्थानांतरण और, एक छोटे विंदुक टिप का उपयोग कर, ध्यान से ऑर्गेनोइड के आसपास सभी अतिरिक्त मीडिया को हटा दें (इस प्रक्रिया के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 3 देखें)।
    नोट: सेल व्यवहार्यता परख ऑर्गेनोइड है कि कोशिकाओं की समान संख्या के साथ किए गए थे के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए। यह प्रयोग सर्जरी से रोगी के नमूनों से सीधे किए गए ऑर्गेनोइड पर नहीं किया जाना चाहिए, एल्रेडी गठित ऑर्गेनोइड काटने से, या अन्य मामलों में जहां एकल कोशिकाओं को फ़िल्टर और गिना नहीं गया था।
  2. 1: 1 अनुपात में ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख अभिकर्मक और 1 एक्स पीबीएस तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में 500 μL जोड़ें।
  3. ऑर्गेनॉइड को तोड़ने के लिए आक्रामक रूप से पिपेट ऊपर और नीचे पिपेट करने के लिए एक पी 1000 पिपेट टिप का उपयोग करें और 5 मिनट के लिए बैठने दें। ऑर्गेनोइड अब तक कुछ हद तक अलग और नरम होना चाहिए; फिर से पी 1000 पिपेट टिप के साथ मिश्रण दोहराएं।
  4. लक्ष्य 96-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से 100 μL कुल मात्रा है। चरण 9.3 से मिश्रण के 25 μL जोड़ें (एकाधिक तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए पर्याप्त होगा) और शेष ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख और पीबीएस मिश्रण के 75 μL जोड़ें।
  5. 2 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर थाली रखें और फिर आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. एक प्लेट रीडर पर एक ल्यूमिनेसेंस सेटिंग का उपयोग करके प्लेट पढ़ें और डेटा एकत्र करें ( चित्रा 4 देखें)।

Representative Results

चित्रा 1 10x आवर्धन पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखा प्रारंभिक ऑर्गेनोइड वृद्धि से पता चलता है। चित्रा 1 ए केंद्र दृश्य में एलआरईसीएम के माध्यम से एकल कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण को दर्शाता है। कोशिकाएं एलआरईसीएम का विस्तार और 'उपनिवेश' करना जारी रखेंगी, और वे दृश्य निरीक्षण द्वारा अधिक घने और अंततः अपारदर्शी दिखाई देंगे। चित्रा 1 बी एक डाइम के आकार के सापेक्ष, आवर्धन के बिना कई परिपक्व ऑर्गेनोइड (7 सप्ताह में) दिखाता है।

चित्रा 2 फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 के लिए जीबीएम ऑर्गेनोइड के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला को दर्शाता है, जो सक्रिय प्रसार का एक मार्कर है। ऑर्गेनोइड कोर की तुलना में ऑर्गेनोइड परिधि में सबसे अधिक प्रसार कोशिकाएं देखी जाती हैं। सकारात्मक धुंधला एक भूरे रंग / तांबे की उपस्थिति होगी।

चित्रा 3 एक 3 डी विशिष्ट ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग करके जीबीएम ऑर्गेनोइड में कुल सेल नंबर को समरूप और मापने की प्रक्रिया का वर्णन करता है। जीबीएम ऑर्गेनोइड में मौजूद कोशिकाओं की उच्च संख्या के कारण, बड़े ऑर्गेनोइड संरचना को शुरू में ल्यूमिनेसेंट परख अभिकर्मक में ट्राइट्यूरेटिंग द्वारा समरूप किया जाता है। फिर कुल ऑर्गेनोइड लाइसेट के अंशों को व्यक्तिगत कुओं में लोड किया जाता है और एक उपयुक्त बहु-अच्छी तरह से प्लेट रीडर पर इनक्यूबेशन और पढ़ने से पहले अतिरिक्त ल्यूमिनेसेंट परख अभिकर्मक के साथ पतला किया जाता है।

चित्रा 4 ऑर्गेनोइड के लिए डीएमएसओ (सामान्य वाहन) नियंत्रण डेटा का प्रतिनिधित्व करता है। प्लॉटेड डेटा इंट्रा-ऑर्गेनॉइड और इंटर-ऑर्गेनॉइड स्थिरता का प्रदर्शन करता है। प्रयोगात्मक डेटा उत्पन्न करते समय ल्यूमिनेसेंट व्यवहार्यता डेटा को आमतौर पर प्रत्येक नमूने के लिए नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (10x) के माध्यम से देखें(ए) प्रारंभिक ऑर्गेनोइड वृद्धि लैमिनिन समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स में जीबीएम कोशिकाओं के प्रवास / (बी) एक डाइम के आकार के सापेक्ष परिपक्व ऑर्गेनोइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जीबीएम ऑर्गेनोइड्स की इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (ए, बी) जीबीएम ऑर्गेनोइड सक्रिय प्रसार के लिए फॉस्फो-हिस्टोन एच 3 दाग कोशिकाओं को दिखाते हैं। स्केलबार क्रमशः ए और बी के लिए 600 μm और 300 μm हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ऑर्गेनोइड के लिए ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता प्रोटोकॉल (ए) छोटे अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए व्यक्तिगत ऑर्गेनोइड ले जाएँ और अतिरिक्त मीडिया को हटा दें। (बी) ऑर्गेनोइड को तोड़ने के लिए आक्रामक रूप से प्रत्येक ट्यूब और पिपेट के लिए 1: 1 पीबीएस और ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख मिश्रण के 500 μL जोड़ें। (सी) इस ऑर्गेनोइड मिश्रण के 25 μL और एक ही 1: 1 पीबीएस और ल्यूमिनेसेंट सेल व्यवहार्यता परख मिश्रण के 75 μL एक 96 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए जोड़ें। (डी) 2 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखें, इसके बाद आरटी पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेशन करें, और फिर प्लेट रीडर पर ल्यूमिनेसेंस पढ़ें। BioRender.com का उपयोग करके बनाया गया चित्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सेल व्यवहार्यता। "चार रोगी नमूनों के लिए चार ऑर्गेनोइड के छह तकनीकी प्रतिकृतियों के लिए 0.1% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में ऑर्गेनोइड के लिए सेल व्यवहार्यता डेटा"। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घटक परिमाण
न्यूरोबेसल माध्यम माइनस फिनोल लाल 500 मिलीलीटर
बी -27 पूरक माइनस विटामिन ए (50x) 10 मिलीलीटर
एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक (100x) 5 मिलीलीटर
सोडियम पाइरूवेट (100 एमएम) 5 मिलीलीटर
0.85% एनएसीएल (200 एमएम) में ग्लूटामाइन 5 मिलीलीटर
पुनः संयोजक मानव एफजीएफ बुनियादी (250 μg / 20 μL
पुनः संयोजक मानव ईएफजी प्रोटीन (250 μg / 20 μL
फिनोल लाल 500 μL

तालिका 1: न्यूरोबेसल माध्यम पूर्ण (एनबीएमसी) सूत्रीकरण

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) समय
50% इथेनॉल 3 मिनट
75% इथेनॉल 3 मिनट
95% इथेनॉल 3 मिनट
95% इथेनॉल 4 मिनट
100% इथेनॉल 2 मिनट
100% इथेनॉल 3 मिनट
100% इथेनॉल 4 मिनट
जाइलीन विकल्प 2 मिनट
जाइलीन विकल्प 3 मिनट
जाइलीन विकल्प 4 मिनट
पैराफिन मोम 15 मिनट
पैराफिन मोम 15 मिनट

तालिका 2: छोटे ऑर्गेनोइड के लिए प्रसंस्करण अनुसूची (व्यास में 3 मिमी से नीचे)

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) समय
50% इथेनॉल 6 मिनट
75% इथेनॉल 6 मिनट
95% इथेनॉल 5 मिनट
95% इथेनॉल 8 मिनट
100% इथेनॉल 5 मिनट
100% इथेनॉल 5 मिनट
100% इथेनॉल 8 मिनट
जाइलीन विकल्प 5 मिनट
जाइलीन विकल्प 5 मिनट
जाइलीन विकल्प 8 मिनट
पैराफिन मोम 30 मिनट
पैराफिन मोम 30 मिनट

तालिका 3: बड़े ऑर्गेनोइड के लिए प्रसंस्करण अनुसूची (व्यास में 3 मिमी से ऊपर)

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) समय
हेमटोक्सिलिन 2 मिनट
डीआईएच2ओ चल रहा है 2 मिनट
परमाणु हेमटोक्सिलिन अभिकर्मक को स्पष्ट करता है 1 मिनट
डीआईएच2ओ चल रहा है 1 मिनट
धुंधला अभिकर्मक 1 मिनट
डीआईएच2ओ चल रहा है 2 मिनट
70% इथेनॉल 1 मिनट
100% इथेनॉल 1 मिनट
100% इथेनॉल 1 मिनट
जाइलीन विकल्प 2 मिनट
जाइलीन विकल्प 2 मिनट

तालिका 4: हेमटॉक्सिलिन काउंटरस्टेन

Discussion

जीबीएम ऑर्गेनोइड पारंपरिक क्षेत्रों के लिए एक पूरक संस्कृति विधि है जिसमें अधिक सेलुलर और माइक्रोएनवायरनमेंटल विषमता 4,22,30 शामिल है। हालांकि अधिक समय और संसाधन-गहन, ऑर्गेनोइड संस्कृति इंट्रा-ट्यूमरल व्यवहार और दवा प्रतिरोध के तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।

जीबीएम सीएससी 5,31 की आबादी से प्रेरित है, और इन तरीकों को इस सीएससी आबादी के निरंतर विकास और आत्म-नवीकरण की अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) स्टेम सेल रखरखाव और विकास को बढ़ाने और सक्रिय रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके) सिग्नलिंग प्रदान करने के लिए जाने जाते हैं। जीबीएम ट्यूमर के भीतर विषम सेलुलर आबादी और अलग-अलग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का गठन सीएससी व्यवहार का समर्थन करने पर निर्भर करता है। एक एलआरईसीएम का चयन लैमिनिन समृद्ध मस्तिष्क वातावरण की नकल करता है और आक्रमण द्वारा आत्म-संगठित और पलायन करने के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृति में कोशिकाओं का समर्थन करता है। हालांकि कुछ समूहों ने एलआरईसीएम या ईजीएफ / एफजीएफ समृद्ध मीडिया24,28 के उपयोग के बिना ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की है, जो इस संस्कृति विधि के अधिक समय-कुशल तरीके और विकास को चलाने के लिए ऑन्कोजेनिक सिग्नलिंग के मजबूत चयन की पेशकश कर सकता है, इन तरीकों को ऑर्गेनोइड की सेलुलर विषमता को सर्वोत्तम रूप से स्थापित करने के लिए प्रो-स्टेम सेल पर्यावरण को अनुकूलित करने के लिए चुना गया था। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड और जीबीएम ऑर्गेनोइड दोनों को साहित्य में एलआरईसीएम के साथ पहले21,32,33 बनाया गया है। यद्यपि हमने ऑर्गेनोइड और स्थानिक भिन्नता के भीतर पाए जाने वाले ट्यूमर आबादी के बारे में डेटा स्थापित किया है, ऑर्गेनोइड के भीतर गैर-ट्यूमर आबादी के बारे में कम जाना जाता है और वे मूल रोगी नमूनों से कितने समय तक जीवित रहते हैं। कुछ आईएचसी दाग (जैसे सीडी 45) इस डेटा को प्रदान कर सकते हैं, और ऑर्गेनोइड के साथ भविष्य में अनुसंधान का एक दिलचस्प बिंदु हो सकता है।

ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए इच्छित उपयोग को जानना उचित तरीकों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। विशिष्ट प्रयोगों के लिए बढ़ते समान ऑर्गेनोइड बनाम प्राथमिक नमूनों से ऑर्गेनोइड की स्थापना में थोड़ी अलग प्रक्रियाएं हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति की दिशा में उचित समय और संसाधनों को आवंटित करने में सक्षम होने के लिए एलआरईसीएम मचान में ऑर्गेनोइड कैसे परिपक्व और नेत्रहीन रूप से भरते हैं, इसके लिए प्रशंसा करना महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनोइड में कोशिकाओं के विरल क्षेत्र धीरे-धीरे विस्तार करेंगे और एलआरईसीएम को भरने के लिए बढ़ेंगे, जो नमूने के व्यवहार के आधार पर 2-8 सप्ताह से कहीं भी ले सकते हैं। विकास की यह दर प्रत्येक नमूने के लिए कुछ हद तक आंतरिक है; यह ऑर्गेनोइड के विभिन्न बैचों में संरक्षित है और क्षेत्र के विकास की सापेक्ष दर के साथ काफी सुसंगत है। ऑर्गेनोइड को 1 वर्ष से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है और चूहों में ज़ेनोग्राफ्ट पर ट्यूमर गठन क्षमताओं को बनाए रखा जा सकता है; हालाँकि, उन्हें एक अलग उद्देश्य के साथ विकसित करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि प्रयोगशाला संसाधनों (सामग्री और समय दोनों) को बर्बाद नहीं किया जाता है। ऑर्गेनोइड वृद्धि को कई अच्छी तरह से आकारों और प्रारूपों में परीक्षण किया गया है, और यह दर्शाता है कि 10 सेमी प्लेट इष्टतम सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आदर्श सेटिंग है, इसके बाद प्रति अच्छी तरह से34 में तीन ऑर्गेनोइड के साथ 6-अच्छी प्लेट है। ऑर्गेनोइड अपने दो-आयामी संस्कृति समकक्षों की तुलना में अधिक मीडिया का उपभोग करते हैं, और एक छोटे अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करने से उचित रखरखाव नहीं होता है। उदाहरण के लिए, 96-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट के एक कुएं में ऑर्गेनोइड विकास को बनाए रखने के लिए ऑर्गेनोइड के आकार के सापेक्ष पर्याप्त स्थान या मीडिया वॉल्यूम नहीं होता है।

जैसा कि ऑर्गेनोइड स्थापित करते हैं, सफलता बढ़ाने के लिए चौकस होना महत्वपूर्ण है। प्रारंभ में, ऑर्गेनोइड धीरे-धीरे मीडिया का उपभोग करेंगे, लेकिन जैसे-जैसे वे सघन और अधिक परिपक्व होते जाएंगे, वे मीडिया का अधिक तेज़ी से उपभोग करेंगे। मीडिया में फिनोल लाल जोड़ने से मीडिया खपत के संकेतक के रूप में काम करने में मदद मिल सकती है। जब मीडिया अधिक पीला होता है, तो यह हमें खिला पैटर्न को समायोजित करने के लिए प्रेरित कर सकता है, चाहे वह मीडिया की उच्च मात्रा का आदान-प्रदान करना हो, प्लेट में कुल मीडिया राशि में वृद्धि हो, ऑर्गेनोइड को उनके विकास को बनाए रखने के लिए कई सेल संस्कृति प्लेटों के बीच विभाजित करें, या यहां तक कि प्रयोगों के लिए समयरेखा को समायोजित करें।

कई मायनों में, ऑर्गेनोइड कैंसर अनुसंधान करने का एक अक्षम तरीका है। वे लंबे समय के तराजू को शामिल करते हैं, और जीबीएम क्षेत्र संस्कृति की तुलना में महंगे और संसाधन-भारी हैं। हालांकि, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट की तुलना में, सेलुलर और माइक्रोएन्वायरमेंटल विविधता को फिर से बनाने के लिए एक वैकल्पिक विधि, वे अधिक सरल, कम महंगे और नियंत्रणीय हैं। ऑर्गेनोइड का सबसे अच्छा उपयोग कब करना है, इसका चयन कैंसर शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है। वे पारंपरिक क्षेत्र या अनुयायी संस्कृति को बदलने का इरादा नहीं रखते हैं और ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल को प्रतिस्थापित करने के लिए नहीं हैं। ऑर्गेनोइड, जब सही वैज्ञानिक प्रश्न पर लागू होते हैं, तो इन दोनों प्रणालियों के लाभों को जोड़ सकते हैं और हमें ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान का निरीक्षण करने की अनुमति दे सकते हैं जो अन्यथा छिपे रहेंगे। वैज्ञानिक समुदाय केवल यह समझना शुरू कर रहा है कि ऑर्गेनोइड क्या सीखने के अवसर प्रदान करते हैं, लेकिन यह स्पष्ट है कि वे जीबीएम के जटिल जीव विज्ञान को समझने के लिए भविष्य में एक अमूल्य उपकरण होंगे।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम डॉ जस्टिन लाठिया को उनकी अमूल्य सलाह और चल रहे समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम कैटरीना मुरली, लिसा वालेस और माया कैम्ही को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets MP Biomedicals 08980681 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets
96-well PCR plates ThermoFisher Scientific 96-well PCR plates
Accutase ThermoFisher Scientific SCR005 Cell detachment solution
Antibiotic-antimycotic ThermoFisher Scientific 15240062 Antibiotic-antimycotic
B-27 supplement minus vitamin A ThermoFisher Scientific 12587001 B-27 supplement minus vitamin A (50x)
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24590 Bluing reagent
Cell strainer (70 µm) CellTreat Scientific 229483 Cell strainer (70 µm)
CellTiter-Glo 3D Promega G9681 Luminescent cell viability assay
Clarifier 2 ThermoFisher Scientific 7301 Nuclear hematoxylin clarifying reagent
Clear-Rite 3 ThermoFisher Scientific 6901 xylene substitute
Epredia Gill 2 Hematoxylin ThermoFisher Scientific 72504 Hematoxylin
Glutamine in 0.85% NaCl ThermoFisher Scientific 35050061 Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM)
Matrigel ThermoFisher Scientific 354234 Laminin-enriched extracellular matrix
Mini PAP pen ThermoFisher Scientific 008877 Hydrophobic barrier pen
Mounting medium ThermoFisher Scientific 22-050-102 Mounting medium
Neurobasal media minus phenol red ThermoFisher Scientific 12349015 Neurobasal media minus phenol red (500 mL)
Normal donkey serum (NDS) Jackson ImmunoResearch 017-000-121 Normal donkey serum (NDS)
Paraformaldehyde 4% in PBS ThermoFisher Scientific AAJ19943K2 Paraformaldehyde 4% in PBS
Phenol red Sigma P0290 Phenol red (0.5%)
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P10144 Liquid curing mountant
Recombinant human EGF protein R&D systems 236-EG-01M Recombinant human EGF protein (250 µg/mL)
Recombinant human FGF basic R&D systems 4144-TC-01 Recombinant human FGF basic (250 µg/mL)
SignalStain Antibody Diluent Cell Signaling 8112 Antibody diluent
SignalStain Boost IHC Detection Reagent Cell Signaling 8114 Immunohistochemistry detection reagent
SignalStain Citrate Unmasking Solution Cell Signaling 14746 Citrate unmasking solution
Single edge razor blade Uline H-595B Single edge razor blade
Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific 11360070 Sodium pyruvate (100 mM)
Tissue-Tek Cryomolds VWR 25608-916 Disposable cryomolds
Tissue-Tek O.C.T. Compound VWR 25608-930 Optimal cutting temperature compound
Trypan Blue Stain ThermoFisher Scientific T10282 Cell impermeant stain (0.4%)
Xylene ThermoFisher Scientific X3P-1GAL Xylene

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 186
त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति का उपयोग करके मानव ग्लियोब्लास्टोमा सेलुलर विविधता <em>पूर्व विवो</em> को बनाए रखना
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Sundar, S. J., Shakya, S., Recinos, V., Hubert, C. G. Maintaining Human Glioblastoma Cellular Diversity Ex vivo using Three-Dimensional Organoid Culture. J. Vis. Exp. (186), e63745, doi:10.3791/63745 (2022).

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