Kas-iskelet sistemi yaralanması ile ilişkili yara iyileşmesinin incelenmesi genellikle Schwann hücreleri (SC’ler), keratinositler ve fibroblastlar arasındaki in vitro etkileşimlerin değerlendirilmesini gerektirir. Bu protokol, bu birincil hücrelerin insan sünnet derisinden izole edilmesini, kültürlenmesini ve karakterizasyonunu açıklar.
Bu protokol, cildin hızlı enzimatik ayrışmasını kullanarak izolasyon yöntemlerini, kültürleme koşullarını ve insan birincil hücrelerinin yüksek verim ve canlılığa sahip karakterizasyonunu açıklar. Birincil keratinositler, fibroblastlar ve Schwann hücreleri, standart bakım prosedürlerini takiben mevcut olan insan yenidoğan sünnet derisinden toplanır. Çıkarılan cilt dezenfekte edilir ve deri altı yağ ve kas bir neşter kullanılarak çıkarılır. Yöntem, epidermal ve dermal tabakaların enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasından ve ardından bu cilt katmanlarının her birinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için ek enzimatik sindirimden oluşur. Son olarak, tek hücreler, haftalar boyunca büyümeyi ve canlılığı korumak için standart hücre kültürü protokollerini izleyerek uygun hücre kültürü ortamında yetiştirilir. Birlikte, bu basit protokol, cilt-sinir modellerinin in vitro değerlendirmesi için üç hücre tipinin de tek bir deri parçasından izolasyonuna, kültürlenmesine ve karakterizasyonuna izin verir. Ek olarak, bu hücreler birbirleri üzerindeki etkilerini ve in vitro travmaya verdikleri tepkileri, yara iyileşmesi ile ilişkili kültürde robotik olarak gerçekleştirilen çizikler şeklinde ölçmek için ortak kültürlerde birlikte kullanılabilir.
Canlı dokudan türetilen ve in vitro koşullar altında kültürlenen birincil hücreler, fizyolojik durum1’e çok benzer, bu da onları fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri araştırmak için ideal bir model haline getirir. Deri, keratinositler, fibroblastlar, sebositler, melanositler ve in vitro deneyler için izole edilebilen ve kültürlenebilen Schwann hücreleri (SC’ler) dahil olmak üzere çoklu hücre tipleri içerir. Keratinositleri, fibroblastları ve SC’leri tek bir deri parçasından izole etme ve kültürleme yöntemleri tanımlanmamıştır. Bu protokolün amacı iki yönlüdür: 1) dermal SC’lerin izolasyonu ve kültürlenmesi için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem oluşturmak ve 2) keratinositlerin, fibroblastların ve SC’lerin tek bir insan sünnet derisinden izolasyonu için etkili, sağlam bir yöntem kullanmak.
Şu anda, deri keratinositleri 2,3,4 ve fibroblastları 5,6’yı izole etmek için belirlenmiş protokoller vardır. Bu çalışmalar, keratinositlerin, fibroblastların veya her ikisinin deriden izolasyonunu tanımlamaktadır, ancak hiçbir protokol, birincil SC’lerin kültürlerinin insan derisinden nasıl oluşturulacağını ele almamaktadır. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nöronal SC’lerin keratinosit ve fibroblast hücresel süreçlerini modüle ettiğini ve normal cilt fizyolojik fonksiyonlarını düzenlediğini göstermektedir7. SC’ler bu nedenle cilt homeostazı için kritik öneme sahiptir ve mevcut komşu cilt hücresi tiplerinin davranışını etkileyen düzenleyici fizyolojiye önemli ölçüde katkıda bulunur8. Bu nedenle, bu hücre tiplerinin her birinin izolasyonuna izin veren bir protokol, hücre-hücre iletişimi veya hücre tipleri arasında çapraz konuşmayı içeren in vitro deneyler için idealdir.
Bu protokol, tek bir deri parçasından birincil hücrelerin bireysel hücre kültürlerinin kurulmasını tanımlar. Bu protokol, mevcut doku miktarı sınırlı olduğunda özellikle yararlıdır. Ayrıca, üç hücre tipinin de tek bir donörden izole edilmesi, istenen deney sırasında genetiğin etkisini azaltırken, hücre tipleri veya ko-kültür deneyleri arasında sağlam karşılaştırmalara izin verir.
Bu protokol, üç farklı hücre popülasyonunu sünnet derisinin tek bir parçasından, yani keratinositlerden, fibroblastlardan ve Schwann hücrelerinden izole etmek için bir yöntemi tanımlar. Keratinositleri ve fibroblastları 2,3,5,6 izole etmek için birkaç izolasyon protokolü vardır, ancak hiçbiri SC izolasyonunu tanımlamaz. Derideki anahtar yapısal hücreler, keratinositler ve…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Fadia Kamal ve Dr. Reyad Elbarbary’ye laboratuvar araçlarını ve teknik desteği kullanmamıza izin verdikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi Hershey Tıp Merkezi’nden kurumsal desteğe ek olarak, NIH (K08 AR060164-01A) ve DOD’dan (W81XWH-16-1-0725) JC E.’ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
T25 culture flask | Corning | 353109 | |
Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |