Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Summary

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Abstract

A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.

Introduction

A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo ^1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas³. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um século^{atrás, 2}. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnicas mais recentes (por exemplo, microscopia confocal, microtomografia de raios-X) têm a mesma base essencial: conhecimento teórico que permite o desenvolvimento de uma metodologia.

A principal ferramenta na anatomia e morfologia das plantas é a imagem. Apesar do equívoco de que tais análises são observações simples, dando espaço a interpretações subjetivas², analisar e compreender imagens nessa área requer conhecimento dos métodos aplicados (o equipamento, tipo de análise, procedimentos metodológicos), componentes celulares, histoquímica e o corpo vegetal (organização e função tecidual, ontogenia, adaptações morfológicas). Interpretar as imagens obtidas através de uma variedade de métodos pode levar à correlação entre forma e função, decifrando a composição química de uma estrutura, corroborando na descrição da taxa, na compreensão de infecções por fitopatógenos e outras avaliações desse tipo.

Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (MH) (ou seja, plantas não fotossintéticas que obtêm carbono de fungos micorrizais ^4,5), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e relações com a hifa, que são a fonte de nutrientes. Os órgãos subterrâneos das plantas de MS geralmente apresentam importantes adaptações relacionadas à sua associação com fungos do solo, por isso é essencial realizar essas investigações anatômicas e morfológicas⁶. Os órgãos aéreos da espécie MH não devem ser ignorados, pois os endófitos também podem estar presentes nesses tecidos, mesmo que não sejam fungos micorrizais (observações pessoais, ainda não publicadas).

Além da essencialidade bem estabelecida da associação de fungos micorrizais com espécies de MS durante todo o seu ciclo^{de vida 7}, todas as espécies de orquídeas, mesmo as autotróficas, têm um estágio micoheterotrófico obrigatório inicial em ambientes naturais. Ocorre porque o embrião das orquídeas é indiferenciado e carece de endosperm ou cotilledons, sendo assim incapaz de se desenvolver e se estabelecer em ambientes naturais sem o apoio nutricional dos parceiros fúngicos ^4,8. Considerando isso, os protocolos simbióticos de germinação podem ser aplicados não apenas às espécies de MS, mas também às orquídeas fotossintestares, com o objetivo de investigar a especificidade orquídea-fungo no desenvolvimento de germinação e protocorma, metodologia muito aplicada em iniciativas de conservação de espécies ameaçadas ^9,10,11.

Nesta montagem de métodos, descrevemos passos importantes envolvidos na coleta, fixação e armazenamento de amostras de plantas de MS para estudos anatômicos (seção 1), análise de superfície e seleção de amostras (seção 2), métodos de secção (à mão livre: seção 3, microtomia: seção 4, criomicrotomia: seção 5), coloração e montagem (seção 6), fluorescência e microscopia confocal de endofitos fúngicos (seção 7), microscopia eletrônica de varredura (seção 8), e microscopia eletrônica de transmissão (seção 9). Além disso, descrevemos um método de germinação simbiótica para sementes de orquídeas (MH e autotrófico, seção 10), pois os métodos de imagem mencionados anteriormente podem ser aplicados com sucesso para analisar a colonização fúngica de sementes, protocormas e mudas no processo de germinação.

Figura 1: Resumição esquemática dos métodos de imagem. Os esquemas fornecem indicações de etapas de protocolo nas quais são detalhadas. Abreviaturas: GMA = methacrilato glicol, OCT = composto de temperatura de corte ideal, SEM = microscopia eletrônica de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As técnicas de microscopia descritas aqui em detalhes (Figura 1) são precedidas pelas seguintes etapas essenciais: coleta, fixação, desidratação, incorporação e secção de amostras. Como as etapas são variáveis (Figura 1) dependendo da técnica escolhida( s), é importante pensar com antecedência, considerando os fixativos a serem preparados e transportados para o local de coleta, como as amostras devem ser preparadas antes da fixação, os processos de desidratação a serem utilizados (seção 1) e diferentes possibilidades de incorporação e métodos de secção (seções 4, 5, e 9). A Figura 1 resume sequencialmente todas as etapas necessárias para cada técnica de microscopia completamente descrita abaixo.

Protocol

1. Coleta, fixação e manutenção de amostras NOTA: Plantas totalmente MS geralmente podem ser encontradas na floresta escura abaixo da história12,13, principalmente em áreas úmidas e abundantes em lixo, enquanto parcialmente plantas DE MS podem ser encontradas em florestas mais abertas12,13. As plantas de MS geralmente têm órgãos subterrâneos bem desenv…

Representative Results

Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos16. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os p…

Discussion

As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos ^6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes³⁹, e estruturas aéreas e reprodutivas⁴¹ . A botânica estrutural,…

Materials

Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation – OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation – OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation – OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)