تصور تطور الندبة باستخدام فحص SCAD - فحص تندب الجلد خارج الموقع الطبيعي
Summary
يصف هذا البروتوكول توليد نبات اللفافة الجلدية المسمى “SCar مثل الأنسجة في طبق” أو SCAD. يسمح هذا النموذج بتصور غير مسبوق للخلايا الليفية المفردة أثناء تكوين الندبة.
Abstract
إن استجابة الثدييات العالمية لسد جروح الأنسجة العميقة هي من خلال تكوين الندبات وتقلص الأنسجة ، بوساطة الخلايا الليفية المتخصصة في اللفافة. على الرغم من الأهمية السريرية لتشكيل الندوب وضعف التئام الجروح ، فإن فهمنا لديناميكيات الخلايا الليفية اللفافة في التئام الجروح سريع بسبب عدم وجود فحوصات ذات صلة تمكن من التصور المباشر لتصميم رقصات الخلايا الليفية والديناميكيات في البيئات المعقدة مثل جروح الجلد. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتوليد ندوب جلدية خارج الموقع باستخدام SCAD أو “أنسجة تشبه SCar في طبق” تحاكي البيئة المعقدة للجروح الجلدية. في هذا الفحص ، يتم استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم وزراعته رأسا على عقب في الوسائط لمدة 5 أيام ، تتطور خلالها الندوب وتقلصات الجلد بشكل موحد. تتيح هذه المنهجية، إلى جانب نماذج الفئران المعدلة وراثيا الخاصة بسلالة الخلايا الليفية، تصور سلالات الخلايا الليفية الفردية عبر عملية إصلاح الجرح بأكملها. بشكل عام ، يساعد هذا البروتوكول الباحثين في فهم العمليات والآليات الأساسية لإصلاح الجروح ، واستكشاف آثار المعدلات مباشرة على نتائج التئام الجروح.
Introduction
التئام الجروح هو عملية لاستعادة الجروح المخترقة. تؤدي إصابات الأنسجة في اللافقاريات إلى تجديد جزئي أو كامل. في المقابل، تستجيب الثدييات للإصابات العميقة عن طريق التندب، وهي عملية مصممة خصيصا لإغلاق الجروح بسرعة باستخدام سدادات كثيفة من ألياف المصفوفة التي تقلل من المنطقة المخترقة وفي الوقت نفسه تشوه الموقع المصاب بشكل دائم1،2،3. حروق الجلد الكبيرة أو الجروح المفتوحة العميقة في الثدييات تؤدي إلى أنماط ظاهرية مرضية مثل الندوب الضخامية أو الجدرة 4,5. هذه الندوب الوفيرة تسبب عبئا هائلا على أنظمة الرعاية الصحية السريرية والعالمية. في الولايات المتحدة وحدها ، تكلف إدارة الندوب حوالي 10 مليارات دولار سنويا 6,7. لذلك ، هناك حاجة إلى تطوير منهجيات ذات صلة لفهم العمليات والآليات الأساسية التي ينطوي عليها تكوين الندبات بشكل أفضل.
في السنوات الأخيرة ، كشفت مجموعة واسعة من الدراسات التي أجريت على الفئران عن مجموعات من الخلايا الليفية غير المتجانسة ذات القدرات الوظيفية المتميزة بناء على أصولها في مواقع جلدية معينة8،9،10. في الجلد الخلفي ، حدد Rinkevich et al. ، 2015 ، أن مجموعة محددة من الخلايا الليفية مع تعبير جنيني مبكر عن Engrailed-1 (En1) ، تسمى EPF (Engrailed positive Fibroblast) تساهم في تندب الجلد عند الجرح. وعلى العكس من ذلك، فإن سلالة أخرى من الخلايا الليفية ليس لها تاريخ من التعبير المتشابك، وهي الخلايا الليفية السلبية المسننة (ENF)، لا تساهم في تكوين الندبة8. يسمح رسم خرائط المصير لهذه السلالات En1 باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي تحركها Cre والتي تم عبورها إلى خطوط ماوس مراسل التألق مثل R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG) بتصور مجموعات EPF و ENF.
دراسة هجرة الخلايا الليفية في الجسم الحي على مدى عدة أيام محدودة بسبب القيود الأخلاقية والتقنية. علاوة على ذلك ، فإن شاشات مكتبة الأجسام المضادة المركبة والفيروسية والمحايدة لتعديل المسارات المشاركة في الندوب تمثل تحديا تقنيا. تفتقر النماذج المستخدمة سابقا في المختبر أو خارج الجسم الحي إلى القدرة على تصور هجرة الخلايا الليفية وتكوين الندبات في البيئات الدقيقة للبشرة الحقيقية ، والتوحيد في تطور الندبة ، بالإضافة إلى تعقيد الأنسجة التي تحاكي بيئات الجلد في الجسم الحي 11,12. للتغلب على القيود المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير اختبار تندب خارج الجسم الحي يسمى SCAD (الأنسجة الشبيهة ب SCar في طبق) 13،14. يمكن إجراء هذا الفحص البسيط عن طريق استئصال الجلد كامل السماكة 2 مم الذي يحتوي على البشرة والأدمة ومناطق اللفافة تحت الجلد وزراعتها في وسائط DMSO المكملة بالمصل لمدة تصل إلى 5 أيام. الندوب الناتجة عن SCAD تكرر بشكل موثوق السمات المميزة للنسخ والبروتينات في الجسم الحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن SCADs الناتجة عن خطوط الفئران المعدلة وراثيا ذات الصلة (على سبيل المثال ، الفئران En1) التي تم عبورها مع خطوط فأر مراسل الفلورسنت تسمح بتصور ديناميكيات هجرة الخلايا الليفية وتطوير الندوب بدقة غير مسبوقة. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذا النموذج بسهولة لأي تطبيقات عالية الإنتاجية (على سبيل المثال ، المكتبة المركبة أو مكتبة الأجسام المضادة أو الفحص الفيروسي)13،14. في هذه المقالة ، نصف بروتوكولا محسنا لإنشاء SCADs وتطبيقات المعالجة اللاحقة لدراسة ديناميكيات الخلايا والمصفوفة في تطوير الندبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم بالفعل تطوير العديد من النماذج لفهم تكوين الندبات بعد الإصابة. وفي حين أحرز الكثير من أوجه التقدم في هذا الصدد، فإن الآليات الفعلية لا تزال غير واضحة. على النقيض من التقنية السابقة ، يتضمن نموذج SCAD جميع أنواع الخلايا والطبقات الجلدية ، وبالتالي الحفاظ على تعقيد الجلد الأصلي18,1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر جميع المؤلفين المشاركين في Jiang et al. 2020 للمساهمة في تطوير منهجية SCAD13. نشكر الدكتور ستيفن ديتزل ومرفق التصوير الحيوي الأساسي في جامعة لودفيغ ماكسيميلان على الوصول إلى نظام الفوتون المتعدد. تم دعم Y.R. من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21) ، ومنحة مجلس البحوث الأوروبي الموحد (ERC-CoG 819933) ، ومؤسسة LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Biologia do Desenvolvimento. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
