使用SCAD测定可视化疤痕形成 - 一种 非原位 皮肤疤痕测定
Summary
该协议描述了称为“培养皿中的SCar样组织”或SCAD的皮肤筋膜外植体的产生。该模型允许在疤痕形成过程中对单个成纤维细胞进行前所未有的可视化。
Abstract
哺乳动物对密封深部组织伤口的整体反应是通过瘢痕形成和组织收缩，由专门的筋膜成纤维细胞介导。尽管疤痕形成和伤口愈合受损具有临床意义，但由于缺乏相关的测定，我们可以直接可视化成纤维细胞在复杂环境（如皮肤伤口）中的成纤维细胞编导和动力学，因此我们对伤口愈合中筋膜成纤维细胞动力学的理解是粗略的。本文提出了一种使用SCAD或“培养皿中的SCar样组织”来模拟皮肤伤口的复杂环境来生成 异地 皮肤疤痕的方案。在该测定中，切除2mm全厚皮肤并在培养基中倒置培养5天，在此期间疤痕和皮肤挛缩均匀发展。这种方法与成纤维细胞谱系特异性转基因小鼠模型相结合，可以在整个伤口修复过程中可视化单个成纤维细胞谱系。总体而言，该协议有助于研究人员了解伤口修复的基本过程和机制，直接探索调节剂对伤口愈合结果的影响。
Introduction
伤口愈合是恢复破裂伤口的过程。无脊椎动物的组织损伤导致部分或完全再生。相比之下，哺乳动物通过疤痕形成对深部损伤做出反应，这是一种量身定制的过程，用于用密集的基质纤维塞快速密封伤口，从而最大限度地减少破坏区域，同时使受伤部位永久变形1，2，3。哺乳动物的大面积皮肤灼伤或深部开放性伤口导致病理性表型，例如肥厚性或瘢痕疙瘩4，5。这些茂密的疤痕给临床和全球医疗保健系统带来了巨大的负担。仅在美国，疤痕管理每年的成本约为100亿美元，6，7。因此，需要开发相关方法，以更好地了解疤痕形成所涉及的基础过程和机制。
近年来，对小鼠的广泛研究揭示了异质成纤维细胞群体，这些成纤维细胞群体基于它们在某些皮肤位置的起源具有不同的功能效力8，9，10。在后皮中，Rinkevich等人，2015年，发现具有Engrailed-1（En1）早期胚胎表达的特定成纤维细胞群体，称为EPF（Engrailed阳性成纤维细胞）有助于受伤时的皮肤瘢痕形成。相反，另一种没有受累表达史的成纤维细胞谱系，Engrailed阴性成纤维细胞（ENF），不会导致瘢痕形成8。这些En1谱系的命运图谱使用Cre驱动的转基因小鼠品系交叉到荧光报告小鼠品系，如R26mTmG （En1Cre x R26mTmG），可以可视化EPF和ENF种群。
在几天 内 研究体内成纤维细胞迁移受到伦理和技术限制的限制。此外，化合物、病毒和中和抗体库筛选以调节瘢痕形成所涉及的途径在技术上具有挑战性。以前使用的 体外 或 离体 模型缺乏在真实皮肤微环境中可视化成纤维细胞迁移和疤痕形成的能力，疤痕发育的均匀性，以及模拟 体内 皮肤环境的组织复杂性11，12。为了克服上述局限性，我们开发了一种称为SCAD（A培养皿中的SCar样组织）的 离体 瘢痕测定法13，14。这种简单的测定可以通过切除含有表皮，真皮和皮下筋膜区域的2mm全层皮肤并在血清补充的DMSO培养基中培养长达5天来进行。SCAD产生的瘢痕可靠地复制 体内 瘢痕的转录组和蛋白质组学特征。此外，从相关转基因小鼠品系（例如En1小鼠）与荧光报告小鼠品系杂交产生的SCAD能够以前所未有的分辨率可视化成纤维细胞迁移动力学和疤痕发展。此外，该模型可以很容易地适应任何高通量应用（例如，化合物库、抗体库或病毒筛选）13，14。在本文中，我们描述了一种优化的方案，用于生成SCAD和随后的下游处理应用，以研究疤痕发育中的细胞和基质动力学。
Protocol
Representative Results
Discussion
已经开发了几种模型来了解受伤后疤痕的形成。虽然在这方面取得了许多进展，但实际机制仍不清楚。与以前的技术相比，SCAD模型包含所有细胞类型和皮肤层，从而保持了天然皮肤18，19的复杂性。这种方法能够生成基本数据集，这些数据集对于理解驱动疤痕形成的分子机制非常重要。该测定以简单，简约的方式设计，但能够产生基本和功能读数，这对…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Jiang et al. 2020的所有合著者为SCAD方法13的发展做出了贡献。我们感谢Steffen Dietzel博士和路德维希- 马克西米兰斯大学生物成像核心设施对多光子系统的访问。Y.R.得到了Else-Kröner-Fresenius-Stiftung（2016_A21），欧洲研究理事会整合基金（ERC-CoG 819933）和LEO基金会（LF-OC-21-000835）的支持。
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
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