Visualisering af arudvikling ved hjælp af SCAD-assay - Et ex-situ hudardannelsesassay

Summary

Denne protokol beskriver dannelsen af en hud-fascia-eksplantation nævnt “SCar-lignende væv i en skål” eller SCAD. Denne model tillader hidtil uset visualisering af enkeltfibroblaster under ardannelse.

Abstract

Pattedyrs globale reaktion på forsegling af dybe vævssår er gennem ardannelse og vævskontraktion, medieret af specialiserede fasciafibroblaster. På trods af den kliniske betydning af ardannelse og nedsat sårheling er vores forståelse af fascia fibroblastdynamik i sårheling kortvarig på grund af manglen på relevante assays, der muliggør direkte visualisering af fibroblastkoreografi og dynamik i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papir præsenterer en protokol til generering af ex situ hudar ved hjælp af SCAD eller “SCar-lignende væv i en skål”, der efterligner det komplekse miljø af hudsår. I dette assay udskæres 2 mm fuld tykkelse hud og dyrkes på hovedet i medier i 5 dage, hvor ar og hudkontrakturer udvikler sig ensartet. Denne metode kombineret med fibroblast-afstamningsspecifikke transgene musemodeller muliggør visualisering af individuelle fibroblastafstrigninger på tværs af hele sårreparationsprocessen. Samlet set hjælper denne protokol forskere med at forstå grundlæggende processer og mekanismer til sårreparation og direkte udforske virkningerne af modulatorer på sårhelingsresultater.

Introduction

Sårheling er en proces med restaurering af brudte sår. Vævsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fuldstændig regenerering. I modsætning hertil reagerer pattedyr på dyb skade ved ardannelse, en proces, der er skræddersyet til hurtigt at forsegle sår med tætte propper af matrixfibre, der minimerer det brudte område og samtidig permanent deformerer det skadede sted ^1,2,3. Store hudforbrændinger eller dybe åbne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fænotyper såsom hypertrofiske eller keloide ar ^4,5. Disse sprudlende ar forårsager en enorm byrde for kliniske og globale sundhedssystemer. Alene i USA koster arhåndtering omkring 10 milliarder dollars årligt ^6,7. Derfor er det nødvendigt at udvikle relevante metoder for bedre at forstå de fundementale processer og mekanismer, der er involveret i ardannelse.

I de senere år har en bred vifte af undersøgelser i mus afsløret heterogene fibroblastpopulationer med forskellige funktionelle potenser baseret på deres oprindelse på visse hudsteder ^8,9,10. I ryghud identificerede Rinkevich et al., 2015, at en specifik fibroblastpopulation med et tidligt embryonalt udtryk for Engrailed-1 (En1), betegnet EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrager til kutan ardannelse ved såring. Omvendt bidrager en anden fibroblast-slægt uden historie med engrailed ekspression, Engrailed negative fibroblast (ENF), ikke til ardannelse⁸. Skæbnekortlægning af disse En1-slægter ved hjælp af Cre-drevne transgene muselinjer krydset til fluorescensreportermuslinjer såsom R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) muliggør visualisering af EPF- og ENF-populationer.

At studere fibroblastmigration in vivo over flere dage er begrænset af etiske og tekniske begrænsninger. Desuden er sammensatte, virale og neutraliserende antistofbiblioteksskærme til modulering af veje, der er involveret i ardannelse, teknisk udfordrende. Tidligere anvendte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til at visualisere fibroblastmigration og ardannelse i ægte hudmikromiljøer, ensartethed i arudvikling samt vævskompleksitet, der efterligner in vivo-hudmiljøer ^11,12. For at overvinde ovenstående begrænsninger udviklede vi et ex vivo ardannelsesassay nævnt SCAD (SCar-lignende væv i en skål)^13,14. Dette enkle assay kan udføres ved at udskære 2 mm hud i fuld tykkelse, der indeholder epidermis, dermis og subkutane fasciaregioner og dyrke dem i serumstædsede DMSO-medier i op til 5 dage. Ar genereret fra SCAD replikerer pålideligt transkriptomiske og proteomiske kendetegn ved in vivo-ar. Derudover tillader SCAD’er genereret fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krydset med fluorescerende reportermuslinjer visualisering af fibroblastmigrationsdynamik og arudvikling i en hidtil uset opløsning. Desuden kan denne model let tilpasses til alle applikationer med høj gennemstrømning (f.eks. Sammensat bibliotek, antistofbibliotek eller viral screening)^13,14. I denne artikel beskriver vi en optimeret protokol til at generere SCAD’er og efterfølgende downstream-behandlingsapplikationer til at studere cellulær og matrixdynamik i arudvikling.

Protocol

Modellen præsenteret nedenfor giver en detaljeret trinvis beskrivelse af genereringen af SCAD-assay som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD-prøvepræparater blev udført efter ofring af dyrene i henhold til de internationale og øvre Bayerns regerings retningslinjer. Dyrene blev ophuset på dyreanlægget i Helmholtz Centre München. Værelserne blev opretholdt med optimal fugtighed og konstant temperatur med en 12 timers lyscyklus. Dyrene blev forsynet med mad og vand ad libitum…

Representative Results

Generering af SCAD’er kan opdeles i tre vigtige trin: Høst af hud fra P0-P1-mus, generering af biopsistans i fuld tykkelse og efterfølgende dyrkning af individuelle scads op til 5 dage i plader med 96 brønde. Som en udlæsning kan dette assay yderligere anvendes til at analysere de rumlige og tidsmæssige aspekter af ardannelse. Den rumlige analyse anvender 2D og 3D immunmærkning af væv til at studere rumlig lokalisering af cellulære og matrixkomponenter inden for udvikling af arvæv. Spatiotemporale undersøgelser…

Discussion

Flere modeller er allerede udviklet til at forstå ardannelse efter skade. Selv om der er gjort mange fremskridt i denne henseende, men de faktiske mekanismer er stadig ikke klare. I modsætning til den tidligere teknik inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag og opretholder derved kompleksiteten af indfødt hud^18,19. Denne metode er i stand til at generere grundlæggende datasæt, der er vigtige for at forstå molekylære mekanismer, der driver a…

Materials

10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss