הדמיה של התפתחות צלקות באמצעות בדיקת SCAD - בדיקה של צלקות עור לשעבר-situ
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הדור של אקספלנט עור-פאשיה המכונה “SCar כמו רקמה בצלחת” או SCAD. מודל זה מאפשר הדמיה חסרת תקדים של פיברובלסטים בודדים במהלך היווצרות צלקות.
Abstract
התגובה הגלובלית של היונקים לאיטום פצעי רקמות עמוקים היא באמצעות היווצרות צלקות והתכווצות רקמות, המתווכת על ידי פיברובלסטים מיוחדים של החיתולית. למרות המשמעות הקלינית של היווצרות צלקות וריפוי פצעים לקוי, הבנתנו את הדינמיקה הפיברובלסטית של החיתולית בריפוי פצעים היא מעורפלת בשל היעדר מבחנים רלוונטיים המאפשרים הדמיה ישירה של כוריאוגרפיה פיברובלסטית ודינמיקה בסביבות מורכבות כגון פצעים בעור. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת צלקות עור לשעבר באמצעות SCAD או “רקמה דמוית SCar בצלחת A Dish” המחקה את הסביבה המורכבת של פצעי עור. במבחן זה, עור 2 מ”מ בעובי מלא נכרת ומתורבת הפוך במדיה במשך 5 ימים, שבמהלכם צלקות והתכווצויות עור מתפתחות באופן אחיד. מתודולוגיה זו, יחד עם מודלים של עכברים מהונדסים ספציפיים לשושלת פיברובלסטים, מאפשרת הדמיה של שושלות פיברובלסט בודדות לאורך כל תהליך תיקון הפצע. באופן כללי, פרוטוקול זה מסייע לחוקרים להבין תהליכים ומנגנונים בסיסיים של תיקון פצעים, תוך בחינה ישירה של ההשפעות של מודולטורים על תוצאות ריפוי פצעים.
Introduction
ריפוי פצעים הוא תהליך של שחזור פצעים שנפרצו. פגיעות ברקמות אצל חסרי חוליות גורמות להתחדשות חלקית או מלאה. לעומת זאת, יונקים מגיבים לפציעה עמוקה על ידי הצטלקות, תהליך המותאם לאטום פצעים במהירות עם תקעים צפופים של סיבי מטריצה הממזערים את האזור הפרוע ובמקביל מעוותים לצמיתות את האתר הפגוע 1,2,3. כוויות עור גדולות או פצעים פתוחים עמוקים ביונקים גורמים לפנוטיפים פתולוגיים כגון צלקות היפרטרופיות או קלואידיות 4,5. צלקות נשגבות אלה גורמות לעומס עצום על מערכות הבריאות הקליניות והעולמיות. בארה”ב לבדה, ניהול צלקות עולה כ-10 מיליארד דולר בשנה 6,7. לכן, פיתוח מתודולוגיות רלוונטיות נדרש כדי להבין טוב יותר את התהליכים והמנגנונים המממנים המעורבים ביצירת צלקות.
בשנים האחרונות, מגוון רחב של מחקרים בעכברים גילו אוכלוסיות פיברובלסטים הטרוגניות עם עוצמות תפקודיות מובהקות בהתבסס על מקורותיהם במקומות מסוימים בעור 8,9,10. בעור האחורי, Rinkevich et al., 2015, זיהו כי אוכלוסייה פיברובלסטית ספציפית עם ביטוי עוברי מוקדם של Engrailed-1 (En1), המכונה EPF (פיברובלסט חיובי חרוט) תורמת להצטלקות עורית עם פציעה. לעומת זאת, שושלת פיברובלסטית אחרת ללא היסטוריה של ביטוי חרוט, פיברובלסט שלילי חרוט (ENF), אינה תורמת להיווצרותצלקת 8. מיפוי גורל של שושלות En1 אלה באמצעות קווי עכברים מהונדסים מונעי Cre שנחצה לקווי עכברים פלואורסצנטיים כגון R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) מאפשר הדמיה של אוכלוסיות EPF ו- ENF.
חקר נדידת פיברובלסטים in vivo במשך מספר ימים מוגבל על ידי אילוצים אתיים וטכניים. יתר על כן, מסכי ספריית נוגדנים מורכבים, נגיפיים ומנטרלים כדי לווסת מסלולים המעורבים בהצטלקות הם מאתגרים מבחינה טכנית. בעבר נעשה שימוש במודלים של in vitro או ex vivo חסרים את היכולת לדמיין נדידת פיברובלסטים ויצירת צלקות במיקרו-סביבה אמיתית של העור, אחידות בהתפתחות צלקות, כמו גם מורכבות רקמות המחקה סביבות עור in vivo 11,12. כדי להתגבר על המגבלות הנ”ל, פיתחנו מבחן צלקות ex vivo המכונה SCAD (רקמה דמוית SCar בצלחת A)13,14. בדיקה פשוטה זו יכולה להתבצע על ידי כריתת עור בעובי מלא של 2 מ”מ המכיל את האפידרמיס, הדרמיס ואזורי החיתולית התת עוריים ושילובם במדיית DMSO בתוספת סרום למשך עד 5 ימים. צלקות המופקות מ-SCAD משכפלות באופן מהימן סימני היכר תעתיקיים ופרוטאומיים של צלקות in vivo. בנוסף, SCADs שנוצרו מקווי עכברים מהונדסים רלוונטיים (למשל, עכברי En1) שהוצלבו עם קווי עכברים פלואורסצנטיים מאפשרים הדמיה של דינמיקת נדידת פיברובלסטים והתפתחות צלקות ברזולוציה חסרת תקדים. יתר על כן, מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לכל יישומי תפוקה גבוהה (למשל, ספריית תרכובות, ספריית נוגדנים או סינון ויראלי)13,14. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב ליצירת SCADs ויישומי עיבוד במורד הזרם הבאים כדי לחקור את הדינמיקה התאית והמטריקסית בפיתוח צלקות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר דגמים כבר פותחו כדי להבין היווצרות צלקות לאחר פציעה. אמנם נעשו הרבה התקדמויות בעניין זה, אך המנגנונים בפועל עדיין אינם ברורים. בניגוד לטכניקה הקודמת, מודל SCAD משלב את כל סוגי התאים והשכבות העוריות, ובכך שומר על המורכבות של עור מקומי18,19. מתודולוגיה זו מסו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכל המחברים השותפים של Jiang et al. 2020 על תרומתם לפיתוח מתודולוגיית SCAD13. אנו מודים לד”ר סטפן דיצל ולמתקן הליבה של הדמיה ביולוגית באוניברסיטת לודוויג-מקסימילנס על הגישה למערכת המולטי-פוטון. י.ר. נתמך על ידי קרן אלזה-קרנר-פרסניוס-ספניוס (2016_A21), מענק איחוד המועצה האירופית למחקר (ERC-CoG 819933) וקרן LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Biologia do Desenvolvimento. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
