ScAD परख का उपयोग कर निशान विकास visualizing - एक पूर्व सीटू त्वचा Scarring परख
Summary
यह प्रोटोकॉल एक त्वचा-प्रावरणी स्पष्टीकरण की पीढ़ी का वर्णन करता है जिसे “एक डिश में ऊतक की तरह स्कार” या एससीएडी कहा जाता है। यह मॉडल निशान गठन के दौरान एकल फाइब्रोब्लास्ट के अभूतपूर्व विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
Abstract
गहरे ऊतक घावों को सील करने के लिए स्तनधारी वैश्विक प्रतिक्रिया निशान गठन और ऊतक संकुचन के माध्यम से होती है, जो विशेष प्रावरणी फाइब्रोब्लास्ट्स द्वारा मध्यस्थता की जाती है। निशान गठन और बिगड़ा घाव भरने के नैदानिक महत्व के बावजूद, घाव भरने में प्रावरणी फाइब्रोब्लास्ट गतिशीलता की हमारी समझ प्रासंगिक assays की कमी के कारण सरसरी है जो त्वचा के घावों जैसे जटिल वातावरण में फाइब्रोब्लास्ट कोरियोग्राफी और गतिशीलता के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करती है। यह पेपर एससीएडी या “एक डिश में स्कार-जैसे ऊतक” का उपयोग करके पूर्व-सीटू त्वचा के निशान उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो त्वचा के घावों के जटिल वातावरण का अनुकरण करता है। इस परख में, 2 मिमी पूर्ण मोटाई त्वचा excised और 5 दिनों के लिए मीडिया में उल्टा नीचे सुसंस्कृत है, जिसके दौरान निशान और त्वचा contractures समान रूप से विकसित. यह पद्धति, फाइब्रोब्लास्ट-वंश विशिष्ट ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ युग्मित, पूरे घाव की मरम्मत प्रक्रिया में व्यक्तिगत फाइब्रोब्लास्ट वंशावली के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाती है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल घाव की मरम्मत की मौलिक प्रक्रियाओं और तंत्र को समझने में शोधकर्ताओं को सहायता करता है, सीधे घाव भरने के परिणामों पर मॉड्यूलेटर के प्रभावों की खोज करता है।
Introduction
घाव भरना टूटे हुए घावों की बहाली की एक प्रक्रिया है। अकशेरुकी में ऊतक की चोटों के परिणामस्वरूप आंशिक या पूर्ण पुनर्जनन होता है। इसके विपरीत, स्तनधारी स्कारिंग द्वारा गहरी चोट का जवाब देते हैं, मैट्रिक्स फाइबर के घने प्लग के साथ घावों को जल्दी से सील करने के लिए तैयार की गई एक प्रक्रिया जो टूटे हुए क्षेत्र को कम करती है और एक ही समय में घायल साइट 1,2,3 को स्थायी रूप से विकृत करती है। स्तनधारियों में बड़ी त्वचा जलने या गहरे खुले घावों के परिणामस्वरूप पैथोलॉजिकल फेनोटाइप जैसे हाइपरट्रॉफिक या केलोइड निशान 4,5 होते हैं। ये विपुल निशान नैदानिक और वैश्विक स्वास्थ्य देखभाल प्रणालियों पर एक जबरदस्त बोझ का कारण बनते हैं। अकेले अमेरिका में, निशान प्रबंधन की लागत लगभग $ 10 बिलियन सालाना 6,7 है। इसलिए, निशान गठन में शामिल फंडेमेंटल प्रक्रियाओं और तंत्रों को बेहतर ढंग से समझने के लिए प्रासंगिक तरीकों के विकास की आवश्यकता होती है।
हाल के वर्षों में, चूहों में अध्ययनों की एक विस्तृत श्रृंखला ने कुछ त्वचा स्थानों 8,9,10 में उनकी उत्पत्ति के आधार पर अलग-अलग कार्यात्मक शक्तिके साथ विषम फाइब्रोब्लास्ट आबादी का खुलासा किया है। पीठ की त्वचा में, रिंकेविच एट अल. 2015, ने पहचाना कि Engrailed-1 (En1) की प्रारंभिक भ्रूण अभिव्यक्ति के साथ एक विशिष्ट फाइब्रोब्लास्ट आबादी, जिसे ईपीएफ (Engrailed positive fibroblast) कहा जाता है, घाव पर त्वचीय स्कारिंग में योगदान देता है। इसके विपरीत, एक और फाइब्रोब्लास्ट वंश जिसमें अभिव्यक्ति का कोई इतिहास नहीं है, Engrailed negative fibroblast (ENF), निशान गठन8 में योगदान नहीं करता है। Cre-संचालित ट्रांसजेनिक माउस लाइनों का उपयोग करके इन En1 वंशों का भाग्य मानचित्रण प्रतिदीप्ति रिपोर्टर माउस लाइनों जैसे R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) को पार कर गया, ईपीएफ और ईएनएफ आबादी के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
कई दिनों में विवो में फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन का अध्ययन नैतिक और तकनीकी बाधाओं द्वारा सीमित है। इसके अलावा, यौगिक, वायरल और बेअसर एंटीबॉडी लाइब्रेरी स्क्रीन स्कारिंग में शामिल मार्गों को संशोधित करने के लिए तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। पहले इन विट्रो या पूर्व विवो मॉडल में उपयोग किए जाने वाले फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन और वास्तविक त्वचा माइक्रोएन्वायरमेंट में निशान गठन की कल्पना करने की क्षमता की कमी है, निशान विकास में एकरूपता, साथ ही ऊतक जटिलता जो विवो त्वचा वातावरणमें अनुकरण करती है 11,12। उपरोक्त सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने एक पूर्व विवो स्कारिंग परख विकसित की जिसे एससीएडी (एक डिश में स्कार-जैसे ऊतक) 13,14 कहा जाता है। इस सरल परख excising द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है 2 मिमी पूर्ण मोटाई epidermis युक्त त्वचा, dermis, और चमड़े के नीचे प्रावरणी क्षेत्रों और उन्हें सीरम में culturing-पूरक DMSO मीडिया में अप करने के लिए 5 दिनों के लिए. SCAD से उत्पन्न निशान मज़बूती से vivo निशान में के transcriptomic और प्रोटिओमिक हॉलमार्क दोहराते हैं। इसके अलावा, प्रासंगिक ट्रांसजेनिक माउस लाइनों (जैसे, En1 चूहों) से उत्पन्न एससीएडी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस लाइनों के साथ पार किया गया, जो एक अभूतपूर्व संकल्प पर फाइब्रोब्लास्ट माइग्रेशन गतिशीलता और निशान विकास के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस मॉडल को आसानी से किसी भी उच्च थ्रूपुट अनुप्रयोगों (जैसे, यौगिक पुस्तकालय, एंटीबॉडी लाइब्रेरी, या वायरल स्क्रीनिंग) के लिए अनुकूलित किया जा सकता है 13,14। इस लेख में, हम निशान विकास में सेलुलर और मैट्रिक्स गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एससीएडी और बाद के डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग अनुप्रयोगों को उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
चोट के बाद निशान गठन को समझने के लिए कई मॉडल पहले से ही विकसित किए गए हैं। हालांकि इस संबंध में बहुत सारी प्रगति प्रदान की गई है, लेकिन, वास्तविक तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। पिछली तकनीक के विपरीत, एससीए?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम एससीएडी पद्धति13 के विकास में योगदान देने के लिए जियांग एट अल 2020 के सभी सह-लेखकों को स्वीकार करते हैं। हम Multiphoton प्रणाली तक पहुंच के लिए लुडविग-Maximilans-Universität में डॉ Steffen Dietzel और Bioimaging कोर सुविधा को धन्यवाद देते हैं। Y.R. Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), यूरोपीय अनुसंधान परिषद समेकितकर्ता अनुदान (ERC-CoG 819933), और LEO फाउंडेशन (LF-OC-21-000835) द्वारा समर्थित था।
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
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