Visualizzazione dello sviluppo delle cicatrici utilizzando il test SCAD - Un test di cicatrici cutanee ex-situ
Summary
Questo protocollo descrive la generazione di un espianto della fascia cutanea chiamato “SCar like tissue in A Dish” o SCAD. Questo modello consente una visualizzazione senza precedenti di singoli fibroblasti durante la formazione di cicatrici.
Abstract
La risposta globale dei mammiferi alla sigillatura delle ferite dei tessuti profondi è attraverso la formazione di cicatrici e la contrazione dei tessuti, mediata da fibroblasti della fascia specializzati. Nonostante il significato clinico della formazione di cicatrici e della compromissione della guarigione delle ferite, la nostra comprensione delle dinamiche dei fibroblasti della fascia nella guarigione delle ferite è superficiale a causa della mancanza di saggi pertinenti che consentano la visualizzazione diretta della coreografia e della dinamica dei fibroblasti in ambienti complessi come le ferite cutanee. Questo documento presenta un protocollo per generare cicatrici cutanee ex-situ utilizzando SCAD o “tessuto simile a SCar in A Dish” che emulano il complesso ambiente delle ferite cutanee. In questo test, la pelle a tutto spessore di 2 mm viene asportata e coltivata a testa in giù nei mezzi per 5 giorni, durante i quali cicatrici e contratture cutanee si sviluppano uniformemente. Questa metodologia, abbinata a modelli murini transgenici specifici per il lignaggio dei fibroblasti, consente la visualizzazione dei singoli lignaggi dei fibroblasti durante l’intero processo di riparazione della ferita. Nel complesso, questo protocollo aiuta i ricercatori a comprendere i processi e i meccanismi fondamentali della riparazione delle ferite, esplorando direttamente gli effetti dei modulatori sui risultati della guarigione delle ferite.
Introduction
La guarigione delle ferite è un processo di ripristino delle ferite violate. Le lesioni tissutali negli invertebrati provocano una rigenerazione parziale o completa. Al contrario, i mammiferi rispondono alle lesioni profonde con cicatrici, un processo su misura per sigillare rapidamente le ferite con densi tappi di fibre matriciali che riducono al minimo l’area violata e allo stesso tempo deformano permanentemente il sito ferito 1,2,3. Grandi ustioni cutanee o profonde ferite aperte nei mammiferi provocano fenotipi patologici come cicatrici ipertrofiche o cheloidi 4,5. Queste cicatrici esuberanti causano un enorme onere per i sistemi sanitari clinici e globali. Solo negli Stati Uniti, la gestione delle cicatrici costa circa $ 10 miliardi all’anno 6,7. Pertanto, è necessario lo sviluppo di metodologie pertinenti per comprendere meglio i processi e i meccanismi fundementali coinvolti nella formazione delle cicatrici.
Negli ultimi anni, una vasta gamma di studi sui topi ha rivelato popolazioni eterogenee di fibroblasti con potenze funzionali distinte in base alle loro origini in determinate località cutanee 8,9,10. Nella pelle della schiena, Rinkevich et al., 2015, hanno identificato che una specifica popolazione di fibroblasti con un’espressione embrionale precoce di Engrailed-1 (En1), chiamata EPF (engrailed positive fibroblast) contribuisce alle cicatrici cutanee sulla ferita. Al contrario, un altro lignaggio di fibroblasti senza storia di espressione engrailed, Engrailed negative fibroblast (ENF), non contribuisce alla formazione di cicatrici8. La mappatura del destino di questi lignaggi En1 utilizzando linee di topo transgenico guidate da Cre incrociate a linee di topo reporter a fluorescenza come R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) consente la visualizzazione delle popolazioni EPF ed ENF.
Lo studio della migrazione dei fibroblasti in vivo per diversi giorni è limitato da vincoli etici e tecnici. Inoltre, gli screening della libreria di anticorpi composti, virali e neutralizzanti per modulare i percorsi coinvolti nelle cicatrici sono tecnicamente impegnativi. I modelli precedentemente utilizzati in vitro o ex vivo non hanno la capacità di visualizzare la migrazione dei fibroblasti e la formazione di cicatrici in microambienti cutanei autentici, l’uniformità nello sviluppo delle cicatrici e la complessità dei tessuti che emula gli ambienti cutanei in vivo 11,12. Per superare le limitazioni di cui sopra, abbiamo sviluppato un saggio di cicatrici ex vivo chiamato SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Questo semplice test può essere eseguito asportando la pelle a tutto spessore di 2 mm contenente l’epidermide, il derma e le regioni della fascia sottocutanea e coltivandole in mezzi DMSO integrati con siero per un massimo di 5 giorni. Le cicatrici generate da SCAD replicano in modo affidabile i segni trascrittomici e proteomici delle cicatrici in vivo. Inoltre, gli SCAD generati da linee di topo transgeniche rilevanti (ad esempio, topi En1) incrociati con linee di topo reporter fluorescenti consentono la visualizzazione delle dinamiche di migrazione dei fibroblasti e lo sviluppo di cicatrici a una risoluzione senza precedenti. Inoltre, questo modello può essere facilmente adattato per qualsiasi applicazione ad alto rendimento (ad esempio, libreria di composti, libreria di anticorpi o screening virale)13,14. In questo articolo, descriviamo un protocollo ottimizzato per generare SCAD e successive applicazioni di elaborazione a valle per studiare le dinamiche cellulari e matriciali nello sviluppo di cicatrici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi modelli sono già stati sviluppati per comprendere la formazione di cicatrici dopo l’infortunio. Mentre molti progressi sono stati fatti in questo senso, ma i meccanismi effettivi non sono ancora chiari. In contrasto con la tecnica precedente, il modello SCAD incorpora tutti i tipi di cellule e gli strati cutanei, mantenendo così la complessità della pelle nativa18,19. Questa metodologia è in grado di generare set di dati fondamentali che sono importan…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo tutti i co-autori di Jiang et al. 2020 per aver contribuito allo sviluppo della metodologia SCAD13. Ringraziamo il Dr. Steffen Dietzel e la struttura centrale di Bioimaging presso la Ludwig-Maximilans-Universität per l’accesso al sistema Multiphoton. Y.R. è stato sostenuto dalla Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), dall’European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) e dalla LEO Foundation (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
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