SCADアッセイを使用した瘢痕発生の可視化 - ex situ 皮膚瘢痕化アッセイ
Summary
このプロトコルは、「A DishのSCar様組織」またはSCADと呼ばれる皮膚筋膜外植体の生成を記述する。このモデルは、瘢痕形成中の単一線維芽細胞の前例のない視覚化を可能にする。
Abstract
深部組織創傷の封入に対する哺乳類の世界的な応答は、特殊な筋膜線維芽細胞によって媒介される瘢痕形成および組織収縮によるものである。瘢痕形成および創傷治癒障害の臨床的意義にもかかわらず、創傷治癒における筋膜線維芽細胞動態の我々の理解は、皮膚創傷などの複雑な環境における線維芽細胞振り付けおよび動態の直接可視化を可能にする関連アッセイの欠如のために大雑把である。この論文は、皮膚創傷の複雑な環境をエミュレートするSCADまたは「A Dish内のSCar様組織」を使用して 、その場で 皮膚瘢痕を生成するためのプロトコルを提示する。このアッセイでは、2mmの全厚皮膚を切除し、培地中で5日間逆さまに培養し、その間に瘢痕および皮膚拘縮が均一に発達する。この方法論は、線維芽細胞系譜特異的トランスジェニックマウスモデルと相まって、創傷修復プロセス全体にわたる個々の線維芽細胞系統の視覚化を可能にする。全体として、このプロトコルは、創傷修復の基本的なプロセスとメカニズムを理解する上で研究者を支援し、創傷治癒結果に対するモジュレーターの効果を直接探求する。
Introduction
創傷治癒は、破られた創傷の修復のプロセスである。無脊椎動物の組織損傷は、部分的または完全な再生をもたらす。対照的に、哺乳動物は、損傷部位1、2、3を永久に変形させるマトリックス繊維の緻密なプラグで創傷を迅速に密封するように調整されたプロセスである瘢痕化によって深い傷害に応答する。哺乳類における大きな皮膚火傷または深く開いた創傷は、肥厚性またはケロイド瘢痕などの病理学的表現型をもたらす4,5。これらの熱狂的な傷跡は、臨床および世界の医療システムに多大な負担を引き起こします。米国だけでも、瘢痕管理には年間約100億ドルの費用がかかります6,7。したがって、瘢痕形成に関与する基礎プロセスおよびメカニズムをよりよく理解するために、関連する方法論の開発が必要である。
近年、マウスにおける広範囲の研究により、特定の皮膚位置におけるそれらの起源に基づいて、別個の機能的効力を有する不均一な線維芽細胞集団が明らかになった8、9、10。背部皮膚において、Rinkevich et al., 2015は、EPF(Engrailed 陽性線維芽細胞)と呼ばれるEngrailed-1(En1)の初期胚性発現を有する特定の線維芽細胞集団が、創傷時の皮膚瘢痕化に寄与することを同定した。逆に、エングレイル発現の病歴のない別の線維芽細胞系統、エングレイルドネガティブ線維芽細胞(ENF)は、瘢痕形成8に寄与しない。R26 mTmG(En1Cre x R26mTmG)などの蛍光レポーターマウス系統に交差したCre駆動トランスジェニックマウス系統を用いたこれらのEn1系統の運命マッピングは、EPFおよびENF集団の可視化を可能にする。
数日間にわたるインビボでの線維芽細胞移動を研究することは、倫理的および技術的制約によって制限される。さらに、化合物、ウイルスおよび中和抗体ライブラリーをスクリーニングして、瘢痕化に関与する経路を調節することは技術的に困難である。以前に使用されていたインビトロまたはエキソビボモデルは、本物の皮膚微小環境における線維芽細胞移動および瘢痕形成、瘢痕発生における均一性、ならびにインビボ皮膚環境をエミュレートする組織の複雑さを視覚化する能力を欠いている11、12。上記の制限を克服するために、我々はSCAD(A Dish中のSCar様組織)13,14と呼ばれるエクスビボ瘢痕化アッセイを開発しました。この簡単なアッセイは、表皮、真皮、および皮下筋膜領域を含む2mmの全厚皮膚を切除し、血清補充DMSO培地中で最大5日間培養することによって行うことができる。SCADから生成された瘢痕は、インビボ瘢痕のトランスクリプトームおよびプロテオミクスの特徴を確実に複製する。さらに、蛍光レポーターマウス系統と交配した関連するトランスジェニックマウス系統(例えば、En1マウス)から生成されたSCADは、線維芽細胞遊走ダイナミクスおよび瘢痕発生を前例のない解像度で視覚化することを可能にする。さらに、このモデルは、あらゆるハイスループットアプリケーション(例えば、化合物ライブラリー、抗体ライブラリー、またはウイルススクリーニング)に容易に適合させることができる13、14。この記事では、SCADを生成するための最適化されたプロトコルと、その後のダウンストリーム処理アプリケーションを使用して、瘢痕発生における細胞およびマトリックスのダイナミクスを研究します。
Protocol
Representative Results
Discussion
傷害後の瘢痕形成を理解するために、いくつかのモデルがすでに開発されている。この点で多くの進歩がもたらされましたが、実際のメカニズムはまだ明らかではありません。前の技術とは対照的に、SCADモデルは、すべての細胞型および皮膚層を組み込んでおり、それによって天然皮膚の複雑さを維持している18、19。この方法論は、瘢痕形成を促…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、SCAD方法論13の開発に貢献したJiang et al. 2020のすべての共著者に謝意を呈する。我々は、多光子システムへのアクセスについて、シュテフェン・ディーツェル博士とルートヴィヒ・マクシミランス大学のバイオイメージングコア施設に感謝する。Y.R.は、Else-Kröner-Fresenius-Stiftung(2016_A21)、European Research Council Consolidator Grant(ERC-CoG 819933)、LEO Foundation(LF-OC-21-000835)の支援を受けました。
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Biologia do Desenvolvimento. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
