SCAD 분석을 사용한 흉터 발달 시각화 - 전 계내 피부 흉터 분석
Summary
이 프로토콜은 “A Dish의 조직과 같은 SCar”또는 SCAD라고 불리는 피부 근막 외래 식물의 생성을 설명합니다. 이 모델은 흉터 형성 동안 단일 섬유 아세포의 전례없는 시각화를 허용합니다.
Abstract
깊은 조직 상처 밀봉에 대한 포유류의 세계적인 반응은 흉터 형성 및 조직 수축을 통해 이루어지며, 이는 전문화된 근막 섬유아세포에 의해 매개된다. 흉터 형성 및 손상된 상처 치유의 임상 적 중요성에도 불구하고, 상처 치유에서 근막 섬유 아세포 역학에 대한 우리의 이해는 피부 상처와 같은 복잡한 환경에서 섬유 아세포 안무 및 역학의 직접적인 시각화를 가능하게하는 관련 분석이 부족하기 때문에 까다 롭습니다. 이 논문은 피부 상처의 복잡한 환경을 모방하는 SCAD 또는 “접시의 SCar-유사 조직”을 사용하여 ex-situ 피부 흉터를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석에서, 2mm 전체 두께의 피부를 적출하고 5 일 동안 배지에서 거꾸로 배양하여 흉터와 피부 수축이 균일하게 발생합니다. 섬유아세포-계보 특이적 트랜스제닉 마우스 모델과 결합된 이 방법론은 전체 상처 복구 과정에 걸쳐 개별 섬유아세포 혈통을 시각화할 수 있게 한다. 전반적으로,이 프로토콜은 연구자가 상처 복구의 기본 과정과 메커니즘을 이해하고 상처 치유 결과에 대한 조절제의 효과를 직접 탐구하는 데 도움을줍니다.
Introduction
상처 치유는 침해 된 상처의 회복 과정입니다. 무척추 동물의 조직 손상은 부분적 또는 완전한 재생을 초래합니다. 대조적으로, 포유류는 흉터에 의한 깊은 부상에 반응하는데, 이는 침범 부위를 최소화 하고 동시에 부상당한 부위 1,2,3을 영구적으로 변형시키는 매트릭스 섬유의 조밀 한 플러그로 상처를 신속하게 봉인하도록 맞춤화 된 과정입니다. 포유류의 큰 피부 화상이나 깊은 열린 상처는 비후성 또는 켈로이드 흉터 4,5와 같은 병리학 적 표현형을 초래합니다. 이러한 풍부한 흉터는 임상 및 글로벌 의료 시스템에 엄청난 부담을 안겨줍니다. 미국에서만 흉터 관리 비용은 연간 약 100 억 달러 6,7입니다. 따라서 흉터 형성과 관련된 기금 과정과 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해서는 관련 방법론의 개발이 필요합니다.
최근 몇 년 동안, 마우스에 대한 광범위한 연구는 특정 피부 위치 8,9,10에서 기원에 따라 뚜렷한 기능적 효능을 가진 이질적인 섬유 아세포 집단을 밝혀 냈습니다. 허리 피부에서, Rinkevich et al., 2015는 EPF (Engrailed positive fibroblast)라고 불리는 Engrailed-1 (En1)의 초기 배아 발현을 가진 특정 섬유 아세포 집단이 상처시 피부 흉터에 기여한다는 것을 확인했습니다. 반대로, 엥레일 발현의 이력이 없는 또 다른 섬유아세포 계통인 Engrailed negative fibroblast (ENF)는 흉터 형성에 기여하지 않는다8. R26 mTmG (En1Cre x R26mTmG)와 같은 형광 리포터 마우스 라인으로 교차된 Cre 구동 트랜스제닉 마우스 라인을 사용하여 이들 En1 계통의 운명 매핑은 EPF 및 ENF 집단의 시각화를 가능하게 한다.
수일에 걸쳐 생체 내에서 섬유아세포 이동을 연구하는 것은 윤리적 및 기술적 제약에 의해 제한된다. 더욱이, 화합물, 바이러스 및 중화 항체 라이브러리 스크린은 흉터에 관여하는 경로를 조절하기 위해 기술적으로 도전적이다. 이전에 사용된 시험관내 또는 생체외 모델은 진정한 피부 미세환경에서의 섬유아세포 이동 및 흉터 형성, 흉터 발달에서의 균일성, 생체내 피부 환경을 에뮬레이트하는 조직 복잡성을 시각화하는 능력이 부족하다(11,12). 상기 한계를 극복하기 위해, 우리는 SCAD (A Dish의 SCar 유사 조직)13,14로 불리는 생체외 흉터 분석 방법을 개발하였다. 이 간단한 분석은 표피, 진피 및 피하 근막 영역을 함유하는 2mm 전두께의 피부를 절제하고 이를 혈청이 보충된 DMSO 배지에서 최대 5일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. SCAD로부터 생성된 흉터는 생체내 흉터의 전사체 및 프로테오믹 특징을 신뢰성 있게 복제한다. 또한, 형광 리포터 마우스 라인과 교차된 관련 트랜스제닉 마우스 라인(예를 들어, En1 마우스)으로부터 생성된 SCADs는 전례 없는 해상도에서 섬유아세포 이동 역학 및 흉터 발달의 시각화를 허용한다. 또한, 이 모델은 임의의 높은 처리량 응용(예를 들어, 화합물 라이브러리, 항체 라이브러리, 또는 바이러스 스크리닝)13,14)에 용이하게 적응될 수 있다. 이 기사에서는 SCAD를 생성하는 최적화된 프로토콜 및 흉터 개발에서 세포 및 매트릭스 역학을 연구하기 위한 후속 다운스트림 처리 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
부상 후 흉터 형성을 이해하기 위해 이미 여러 모델이 개발되었습니다. 이와 관련하여 많은 발전이 이루어졌지만 실제 메커니즘은 여전히 명확하지 않습니다. 이전의 기술과는 달리, SCAD 모델은 모든 세포 유형 및 피부 층을 통합하여, 천연 피부(18,19)의 복잡성을 유지한다. 이 방법론은 흉터 형성을 유도하는 분자 메커니즘을 이해하는 데 중요한 기본 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 SCAD 방법론13의 개발에 기여한 Jiang et al. 2020의 모든 공동 저자를 인정합니다. Multiphoton 시스템에 대한 액세스를 위해 Steffen Dietzel 박사와 Ludwig-Maximilans-Universität의 Bioimaging 핵심 시설에 감사드립니다. Y.R.은 Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), ERC-CoG 819933 European Research Council Consolidator Grant 및 LEO Foundation (LF-OC-21-000835)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
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