Visualisere arrutvikling ved hjelp av SCAD Assay - En Ex-situ skin scarring assay

Summary

Denne protokollen beskriver genereringen av en hudfascia utviset kalt “SCar like tissue in A Dish” eller SCAD. Denne modellen tillater enestående visualisering av enkle fibroblaster under arrdannelse.

Abstract

Pattedyrets globale respons på tetting av dype vevssår er gjennom arrdannelse og vevskontraksjon, mediert av spesialiserte fasciafibroblaster. Til tross for den kliniske betydningen av arrdannelse og nedsatt sårheling, er vår forståelse av fascia fibroblastdynamikk i sårheling kortfattet på grunn av mangel på relevante analyser som muliggjør direkte visualisering av fibroblastkoreografi og dynamikk i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papiret presenterer en protokoll for å generere ex-situ hud arr ved hjelp av SCAD eller “SCar-lignende vev i en tallerken” som etterligner det komplekse miljøet av hudsår. I denne analysen utskilles 2 mm hud med full tykkelse og dyrkes opp ned i media i 5 dager, hvor arr og hudkontrakturer utvikler seg jevnt. Denne metodikken, kombinert med fibroblast-avledningsspesifikke transgene musemodeller, muliggjør visualisering av individuelle fibroblastavledninger over hele sårreparasjonsprosessen. Samlet sett hjelper denne protokollen forskere med å forstå grunnleggende prosesser og mekanismer for sårreparasjon, og utforsker direkte effekten av modulatorer på sårhelingsresultater.

Introduction

Sårheling er en prosess for restaurering av brutte sår. Vevsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fullstendig regenerering. I motsetning reagerer pattedyr på dyp skade ved arrdannelse, en prosess skreddersydd for raskt å forsegle sår med tette plugger av matrisefibre som minimerer det brutte området og samtidig permanent deformerer det skadede stedet ^1,2,3. Store hudforbrenninger eller dype åpne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fenotyper som hypertrofiske eller keloid arr ^4,5. Disse sprudlende arrene forårsaker en enorm byrde på kliniske og globale helsesystemer. Bare i USA koster arrhåndtering rundt 10 milliarder dollar årlig ^6,7. Derfor er utviklingen av relevante metoder nødvendig for å bedre forstå de fundementale prosessene og mekanismene som er involvert i arrdannelse.

I de senere år har et bredt spekter av studier på mus avslørt heterogene fibroblastpopulasjoner med distinkte funksjonelle potenser basert på deres opprinnelse på visse hudsteder ^8,9,10. I bakhuden identifiserte Rinkevich et al., 2015, at en bestemt fibroblastpopulasjon med et tidlig embryonalt uttrykk for Engrailed-1 (En1), kalt EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar til kutan arrdannelse ved såring. Motsatt bidrar en annen fibroblast avledning uten historie med innfelt uttrykk, Innfelt negativ fibroblast (ENF), ikke til arrdannelse⁸. Skjebnekartlegging av disse En1-linjene ved hjelp av Cre-drevne transgene muselinjer krysset til fluorescensreportermuselinjer som R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) tillater visualisering av EPF- og ENF-populasjoner.

Å studere fibroblast migrasjon in vivo over flere dager er begrenset av etiske og tekniske begrensninger. Videre er sammensatte, virale og nøytraliserende antistoffbibliotekskjermer for å modulere veier involvert i arrdannelse teknisk utfordrende. Tidligere brukte in vitro– eller ex vivo-modeller mangler evnen til å visualisere fibroblastmigrasjon og arrdannelse i ekte hudmikromiljøer, ensartethet i arrutvikling, samt vevskompleksitet som emulerer in vivo hudmiljøer^11,12. For å overvinne de ovennevnte begrensningene utviklet vi en ex vivo scarring analyse kalt SCAD (SCar-lignende vev i A Dish)^13,14. Denne enkle analysen kan utføres ved å utskille 2 mm fulltykkelseshud som inneholder epidermis, dermis og de subkutane fasciaområdene og dyrke dem i serum-supplerte DMSO-medier i opptil 5 dager. Arr generert fra SCAD gjenskaper pålitelig transkripsjons- og proteomiske kjennetegn på in vivo arr. I tillegg kan SCADer generert fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krysset med fluorescerende reportermuslinjer tillate visualisering av fibroblast migrasjonsdynamikk og arrutvikling med en enestående oppløsning. Videre kan denne modellen enkelt tilpasses for alle bruksområder med høy gjennomstrømning (f.eks. sammensatt bibliotek, antistoffbibliotek eller viral screening)^13,14. I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert protokoll for å generere SCADs og påfølgende nedstrøms prosesseringsprogrammer for å studere cellulær og matrisedynamikk i arrutvikling.

Protocol

Modellen som presenteres nedenfor gir en detaljert trinnvis beskrivelse av generasjonen av SCAD-analyse som kort beskrevet i Jiang et al., 202013. SCAD prøveforberedelser ble utført etter å ha ofret dyrene i henhold til internasjonale og regjeringen i Øvre Bayern retningslinjer. Dyr ble plassert på dyreanlegget til Helmholtz Centre Munich. Rommene ble opprettholdt med optimal fuktighet og konstant temperatur med en 12 timers lyssyklus. Dyr ble forsynt med mat og vann ad libitum. …

Representative Results

Generering av SCADs kan deles inn i tre viktige trinn: Høsting av tilbake hud fra P0-P1 mus, generering av biopsislag i full tykkelse og påfølgende kultur av individuelle scads opptil 5 dager i 96-brønnsplater. Som en avlesning kan denne analysen videre brukes til å analysere de romlige og tidsmessige aspektene ved arrdannelse. Den romlige analysen benytter 2D og 3D immunmerking av vev for å studere romlig lokalisering av cellulære og matrisekomponenter innen utvikling av arrvev. Romlige studier tillater visualise…

Discussion

Flere modeller er allerede utviklet for å forstå arrdannelse etter skade. Mens mange fremskritt har blitt gjengitt i denne forbindelse, men, er faktiske mekanismer fortsatt ikke klare. I motsetning til den forrige teknikken inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag, og opprettholder dermed kompleksiteten i innfødt hud^18,19. Denne metodikken er i stand til å generere grunnleggende datasett som er viktige for å forstå molekylære mekanismer som…

Materials

10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss