Visualización del desarrollo de cicatrices mediante el ensayo SCAD: un ensayo de cicatrización cutánea ex situ
Summary
Este protocolo describe la generación de un explante de piel-fascia denominado “tejido similar a SCar en un plato” o SCAD. Este modelo permite una visualización sin precedentes de fibroblastos individuales durante la formación de cicatrices.
Abstract
La respuesta global de los mamíferos al sellado de heridas de tejido profundo es a través de la formación de cicatrices y la contracción del tejido, mediada por fibroblastos especializados en la fascia. A pesar de la importancia clínica de la formación de cicatrices y la cicatrización deficiente de heridas, nuestra comprensión de la dinámica de los fibroblastos de la fascia en la cicatrización de heridas es superficial debido a la falta de ensayos relevantes que permitan la visualización directa de la coreografía y la dinámica de los fibroblastos en entornos complejos, como en heridas cutáneas. Este artículo presenta un protocolo para generar cicatrices cutáneas ex situ utilizando SCAD o “tejido similar a SCar en un plato” que emulan el complejo entorno de las heridas cutáneas. En este ensayo, la piel de 2 mm de espesor completo se extirpa y se cultiva boca abajo en medios durante 5 días, durante los cuales las cicatrices y las contracturas de la piel se desarrollan de manera uniforme. Esta metodología, junto con modelos de ratón transgénico específicos del linaje de fibroblastos, permite la visualización de linajes de fibroblastos individuales en todo el proceso de reparación de heridas. En general, este protocolo ayuda a los investigadores a comprender los procesos y mecanismos fundamentales de reparación de heridas, explorando directamente los efectos de los moduladores en los resultados de curación de heridas.
Introduction
La cicatrización de heridas es un proceso de restauración de heridas rotas. Las lesiones tisulares en invertebrados resultan en una regeneración parcial o completa. Por el contrario, los mamíferos responden a las lesiones profundas mediante cicatrices, un proceso diseñado para sellar rápidamente las heridas con densos tapones de fibras de matriz que minimizan el área quebrantada y al mismo tiempo deforman permanentemente el sitio lesionado 1,2,3. Las grandes quemaduras en la piel o las heridas abiertas profundas en los mamíferos dan lugar a fenotipos patológicos como cicatrices hipertróficas o queloides 4,5. Estas cicatrices exuberantes causan una tremenda carga en los sistemas de salud clínicos y globales. Solo en los Estados Unidos, el manejo de cicatrices cuesta alrededor de $ 10 mil millones anuales 6,7. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de metodologías relevantes para comprender mejor los procesos y mecanismos fundementales involucrados en la formación de cicatrices.
En los últimos años, una amplia gama de estudios en ratones ha revelado poblaciones heterogéneas de fibroblastos con distintas potencias funcionales basadas en sus orígenes en ciertas ubicaciones de la piel 8,9,10. En la piel posterior, Rinkevich et al., 2015, identificaron que una población específica de fibroblastos con una expresión embrionaria temprana de Engrailed-1 (En1), denominada EPF (Fibroblasto Positivo Engrailed) contribuye a la cicatrización cutánea al enrollarse. Por el contrario, otro linaje de fibroblastos sin antecedentes de expresión engrailed, el fibroblasto negativo engrailed (ENF), no contribuye a la formación de cicatrices8. El mapeo del destino de estos linajes En1 utilizando líneas de ratones transgénicos impulsadas por Cre cruzadas a líneas de ratón reporteros de fluorescencia como R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) permite la visualización de poblaciones de EPF y ENF.
El estudio de la migración de fibroblastos in vivo durante varios días está limitado por restricciones éticas y técnicas. Además, las pantallas de biblioteca de anticuerpos compuestos, virales y neutralizantes para modular las vías involucradas en la cicatrización son técnicamente desafiantes. Los modelos in vitro o ex vivo utilizados anteriormente carecen de la capacidad de visualizar la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes cutáneos genuinos, uniformidad en el desarrollo de cicatrices, así como complejidad tisular que emula entornos cutáneos in vivo 11,12. Para superar las limitaciones anteriores, desarrollamos un ensayo de cicatrización ex vivo denominado SCAD (SCar-like tissue in A Dish)13,14. Este ensayo simple se puede realizar extirpando la piel de 2 mm de espesor completo que contiene la epidermis, la dermis y las regiones de la fascia subcutánea y cultivándolas en medios DMSO suplementados con suero durante un máximo de 5 días. Las cicatrices generadas a partir de SCAD replican de manera confiable las características transcriptómicas y proteómicas de las cicatrices in vivo. Además, los SCAM generados a partir de líneas de ratones transgénicos relevantes (por ejemplo, ratones En1) cruzados con líneas de ratones reporteros fluorescentes permiten la visualización de la dinámica de migración de fibroblastos y el desarrollo de cicatrices a una resolución sin precedentes. Además, este modelo se puede adaptar fácilmente para cualquier aplicación de alto rendimiento (por ejemplo, biblioteca de compuestos, biblioteca de anticuerpos o cribado viral)13,14. En este artículo, describimos un protocolo optimizado para generar SCADs y posteriores aplicaciones de procesamiento aguas abajo para estudiar la dinámica celular y matricial en el desarrollo de cicatrices.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ya se han desarrollado varios modelos para comprender la formación de cicatrices después de una lesión. Si bien se han logrado muchos avances en este sentido, los mecanismos reales aún no están claros. A diferencia de la técnica anterior, el modelo SCAD incorpora todos los tipos celulares y capas cutáneas, manteniendo así la complejidad de la piel nativa18,19. Esta metodología es capaz de generar conjuntos de datos fundamentales que son importantes para …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos a todos los coautores de Jiang et al. 2020 por contribuir al desarrollo de la metodología SCAD13. Agradecemos al Dr. Steffen Dietzel y a las instalaciones centrales de Bioimagen en la Ludwig-Maximilans-Universität por el acceso al sistema Multiphoton. Y.R. contó con el apoyo de la Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), la European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) y la Fundación LEO (LF-OC-21-000835).
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
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