Visualisera ärrutveckling med SCAD-analys - En ex-situ hudärrbildningsanalys

Summary

Detta protokoll beskriver genereringen av en hudfascia explantad som kallas “SCar som vävnad i en maträtt” eller SCAD. Denna modell möjliggör oöverträffad visualisering av enstaka fibroblaster under ärrbildning.

Abstract

Däggdjurets globala svar på tätning av djupa vävnadssår är genom ärrbildning och vävnadskontraktion, medierad av specialiserade fasciafibroblaster. Trots den kliniska betydelsen av ärrbildning och nedsatt sårläkning är vår förståelse av fasciafibroblastdynamik vid sårläkning kortfattad på grund av bristen på relevanta analyser som möjliggör direkt visualisering av fibroblastkoreografi och dynamik i komplexa miljöer som i hudsår. Detta dokument presenterar ett protokoll för att generera ex- situ hudärr med SCAD eller “SCar-liknande vävnad i en maträtt” som efterliknar den komplexa miljön av hudsår. I denna analys skärs 2 mm hud i full tjocklek ut och odlas upp och ner i media i 5 dagar, under vilka ärr och hudkontrakturer utvecklas enhetligt. Denna metodik, i kombination med fibroblast-härstamningsspecifika transgena musmodeller, möjliggör visualisering av enskilda fibroblastlinjer över hela sårreparationsprocessen. Sammantaget hjälper detta protokoll forskare att förstå grundläggande processer och mekanismer för sårreparation, direkt utforska effekterna av modulatorer på sårläkningsresultat.

Introduction

Sårläkning är en process för restaurering av brutna sår. Vävnadsskador hos ryggradslösa djur resulterar i partiell eller fullständig regenerering. Däremot svarar däggdjur på djup skada genom ärrbildning, en process skräddarsydd för att snabbt täta sår med täta pluggar av matrisfibrer som minimerar det brutna området och samtidigt permanent deformerar det skadade stället ^1,2,3. Stora hudbrännskador eller djupa öppna sår hos däggdjur resulterar i patologiska fenotyper som hypertrofiska eller keloidärr ^4,5. Dessa sprudlande ärr orsakar en enorm börda för kliniska och globala sjukvårdssystem. Bara i USA kostar ärrhantering cirka 10 miljarder dollar årligen ^6,7. Därför krävs utveckling av relevanta metoder för att bättre förstå de fundementala processer och mekanismer som är involverade i ärrbildning.

Under de senaste åren har ett brett spektrum av studier på möss avslöjat heterogena fibroblastpopulationer med distinkta funktionella potenser baserat på deras ursprung på vissa hudplatser ^8,9,10. I bakhuden identifierade Rinkevich et al., 2015, att en specifik fibroblastpopulation med ett tidigt embryonalt uttryck av Engrailed-1 (En1), kallad EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrar till kutan ärrbildning vid sårbildning. Omvänt bidrar en annan fibroblastlinje utan historia av insnärjt uttryck, Engrailed negative fibroblast (ENF), inte till ärrbildning⁸. Ödeskartläggning av dessa En1-linjer med hjälp av Cre-drivna transgena muslinjer korsade till fluorescensreportermuslinjer som R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) möjliggör visualisering av EPF- och ENF-populationer.

Att studera fibroblastmigration in vivo under flera dagar begränsas av etiska och tekniska begränsningar. Dessutom är sammansatta, virala och neutraliserande antikroppsbiblioteksskärmar för att modulera vägar som är involverade i ärrbildning tekniskt utmanande. Tidigare använda in vitro- eller ex vivo-modeller saknar förmågan att visualisera fibroblastmigration och ärrbildning i äkta hudmikromiljöer, enhetlighet i ärrutveckling samt vävnadskomplexitet som emulerar in vivo hudmiljöer^11,12. För att övervinna ovanstående begränsningar utvecklade vi en ex vivo ärrbildningsanalys som kallas SCAD (SCar-liknande vävnad i en maträtt)^13,14. Denna enkla analys kan utföras genom att excitera 2 mm fullhudshud som innehåller epidermis, dermis och subkutan fascia och odla dem i serumkompletterade DMSO-medier i upp till 5 dagar. Ärr som genereras från SCAD replikerar på ett tillförlitligt sätt transkriptomiska och proteomiska kännetecken för in vivo-ärr. Dessutom möjliggör SCAD: er genererade från relevanta transgena muslinjer (t.ex. En1-möss) korsade med fluorescerande reportermuslinjer visualisering av fibroblastmigrationsdynamik och ärrutveckling med en aldrig tidigare skådad upplösning. Dessutom kan denna modell enkelt anpassas för alla applikationer med hög genomströmning (t.ex. sammansatt bibliotek, antikroppsbibliotek eller viral screening)^13,14. I den här artikeln beskriver vi ett optimerat protokoll för att generera SCADs och efterföljande nedströms bearbetningsapplikationer för att studera cell- och matrisdynamik i ärrutveckling.

Protocol

Modellen som presenteras nedan ger en detaljerad steg-för-steg-beskrivning av genereringen av SCAD-analys som kortfattat beskrivs i Jiang et al., 202013. SCAD-provberedningar utfördes efter att djuren offrats enligt de internationella och överbayerska regeringens riktlinjer. Djur inhystes på djuranläggningen i Helmholtzcentret i München. Rummen upprätthölls med optimal luftfuktighet och konstant temperatur med en 12 h ljuscykel. Djur försågs med mat och vatten ad libitum. <p…

Representative Results

Generering av SCADs kan delas in i tre viktiga steg: Skörda tillbaka huden från P0-P1-möss, generera biopsistansar i full tjocklek och efterföljande odling av enskilda scads upp till 5 dagar i 96-brunnsplattor. Som en avläsning kan denna analys vidare tillämpas för att analysera de rumsliga och tidsmässiga aspekterna av ärrbildning. Den rumsliga analysen använder 2D- och 3D-immunmärkning av vävnader för att studera rumslig lokalisering av cellulära och matriskomponenter inom utvecklande ärrvävnad. Spatiot…

Discussion

Flera modeller har redan utvecklats för att förstå ärrbildning efter skada. Även om många framsteg har gjorts i detta avseende, men de faktiska mekanismerna är fortfarande inte tydliga. Till skillnad från den tidigare tekniken innehåller SCAD-modellen alla celltyper och kutana lager, vilket bibehåller komplexiteten hos den ursprungliga huden^18,19. Denna metod kan generera grundläggande datamängder som är viktiga för att förstå molekylära mekanism…

Materials

10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss